多药抗药基因的表达实验

大多MDR细胞膜上出现MDR-1基因及其基因产物P-糖蛋白过度表达。 多药抗药基因的表达实验是通过反转录和PCR的方法来检测这些特定基因的过度表达。

RNA

PBS 氯仿 异丙醇 萘酸 异硫氰酸肽 十二烷基肌酸钠 构橼酸钠 乙酸钠 二疏基乙醇 乙醇 Taq酶

离心机 紫外分光光度计 琼脂糖凝胶电泳 PCR仪

一、细胞总RNA提取

1.  收集约5x10⁷个细胞，冷PBS洗涤。

2.  加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的异硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸钠，0.025 mol/l 构橼酸钠pH7.0，0.25 mol/l 乙酸钠，pH4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混匀。

3.  加入400 ul 氯仿，混匀，以13 000 r/min 于4℃离心15 min。

4.  取上清液加入等体积的异丙醇，4℃放置30 min。

5.  然后以13 000 r/min 离心15 min，吸上清，将RNA成点用75%的乙醇洗涤1次，溶于100 ul 的无菌双蒸馏水中。

6.  并用紫外分光光度计检测RNA纯度（A₂₆₀/A₂₈₀应为1.8~2.0）后备用。

二、反转录及PCR扩增

1.  引物
 

2.  取细胞总RNA10 ul 加入20 ul AMV逆转录酶反应体系中，42℃保温30 min 进行反转录，合成cDNA。

3.  然后置95℃，3 min 终止反转录。

4.  接着在Taq酶的作用下，用mdr-1和β₂-MG引物，对cDNA上的目的片段进行PCR

5.  94℃预变性2 min，然后94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，扩增35个循环。

6.  最终在60℃保温7 min，以保证产物充分延伸。

7.  取10 ul 扩增产物在3%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下照相，与mdr-1 cDNA阳性对照，等位的DNA条带为阳性，反之为阴性。

1. 尽可能在低温下操作；

2. 适量斟酌Trizon等的用量；

3. 在每一次离心后除尽蛋白质、不溶物

提取操作时必须戴手套、口罩等防止DNA酶的影响；

4. 注意Trizon带有腐蚀性；

5. 最重要的就是防止DNase的污染，手套、口罩必不可少，所用的枪头和EP管等也要RNA提取专用的，无DNA酶的。