多酚氧化酶的提取、纯化和活力测定

实验概要

本文介绍了多酚氧化酶提取、纯化和活力测定的原理及方法等。

实验原理

很多植物受到机械损伤时在空气中会逐渐变成褐色，这是损伤时植物细胞破碎，原来彼此分开的多酚氧化酶和多酚类物质接触反应的结果。反应如下：

＋H₂O

多酚氧化酶

＋1/2O₂

多酚氧化酶(po1yphenoloxidase，PP0)是一种含铜酶，它能够催化酚类物质转变成醌。近几十年来，国内外对植物组织褐变的研究表明，组织的褐变主要是PP0作用于天然底物酚类物质所致。

主要试剂

1. 0.025mol/L磷酸钾缓冲液（ pH7.2）

2. 0.15mol/L儿茶酚溶液

3. 10mmol/LTris-HCl溶液（pH8.3）

4. 硫酸铵

主要设备

1. 组织匀浆机

2. 漏斗

3. 滤纸

4. 分光光度计

实验材料

梨

实验步骤

1. 多酚氧化酶(PP0)的提取

   1) 丙酮粉制备：取果肉组织100 g，加入200mL冰丙酮(-20℃左右)，用高速组织捣碎机匀浆5min，混合液用中速滤纸在漏斗架上过滤，残渣用冰丙酮反复冲洗，过滤，直至成为白色粉末，此粉末即为丙酮粉。

   2) 酶液制备：称取1g丙酮粉，加入20ml 0.025mol/L磷酸缓冲液（ pH7.2），0℃下用磁力搅拌器匀浆30min，在12 000rpm下离心30min，取上清液，得粗酶提取液。

2. 多酚氧化酶(PP0)的纯化

向上述酶液中加入NH₄SO₄至为80％饱和溶液，搅拌30min, 过夜，于12 000g离心30min，沉淀溶于0.025mol/L磷酸缓冲液中（pH7.2）, 对10mmol/LTris-HCl溶液（pH8.3）透析18h, 期间更换三次，即为纯化多酚氧化酶。

3. 多酚氧化酶(PP0)活力的测定

以儿茶酚为底物，在25px的比色杯中加入2.75mL 0.025mol/L磷酸缓冲液中（pH7.2）， 0.1mL  0.15mol/L儿茶酚溶液，混匀，室温下放置3分钟后，加入0.1mL酶液,  5s后开始扫描1min内A420值的变化，酶活性以每分钟光吸收值改变0.001所需的酶量为1个活力单位。

注意事项

多酚氧化酶易失活，提取酶时宜在低温下进行。