大蒜幼苗叶片mRNA的制备

实验概要

本实验以大蒜为试材介绍了mRNA制备的制备方法。

主要试剂

Trizol试剂，酚仿混合液(1: 1)，异丙醇，70%乙醇，RNase-free水，OBB缓冲液，Oligotex凝胶悬浮液，OEB溶液，OW2 buffer，3 M NaAc

主要设备

高速离心机，1.5 ml离心管，电泳仪，电泳槽，涡旋器，水浴锅

实验材料

大蒜(Allium Sativum L.)

实验步骤

1. 植物总RNA的提取；

    1) 取100 mg植物材料，于液氮中研磨至粉状，加入1 ml Trizol试剂，上下颠倒数次；

    2) 12000转/min离心5分钟，取上清；

    3) 酚仿混合液(1: 1)抽提两遍，离心取上清；

    4) 加入1体积的异丙淳，沉淀5分钟；

    5) 12000转/min于4℃离心5分钟，去上清；

    6) 70%乙醇洗沉淀两遍；

    7) 室温下干燥10分钟；

    8) 沉淀溶于20 ul，电泳检测。

2. mRNA的纯化

    1) 于1.5 ml离心管中加入250-500 ug总RNA，60℃加热3 min；

    2) 加RNase-free水，漩涡混合5 sec；

    3) 加500 ul OBB缓冲液，30 ul Oligotex凝胶悬浮液，混匀，70℃保温3 min；

    4) 室温放置不超过30 min；

    5) 15 000 X g离心3 min，去上清液；

    6) 加400 ul OW2 buffer悬浮沉淀；

    7) 转移至small spin column中，15 000 X g离心2 min，弃收集液；

    8) 再加400 ul OW2 buffer于small spin column中，15 000 X g离心2 min；

    9) 转移small spin column至一新的RNase-free的1.5 ml离心管中，加50 ul 70℃的OEB溶液，悬浮凝胶。15 000 X g离心2 min。

3. mRNA的浓缩

    1) mRNA溶液中加入1/10体积的3 M NaAc，2倍体积的乙醇。-20℃下放置1 hr；

    2) 8 000 X g离心15 min，弃上清；

    3) 沉淀中加1 ml 70%乙醇，混匀后8 000 X g离心15 min，弃上清；

    4) 将沉淀在空气中干燥10 min，用适量RNase-free水溶解。