大鼠短暂脑缺血术后行为学的评价

摘  要: 目的  观察大脑中动脉阻塞(MCAO) 2 h造成的短暂脑缺血大鼠(MCAO大鼠)行为学表现。方法  采用插线法阻塞成年SD大鼠大脑中动脉制作短暂脑缺血模型,分别对模型大鼠进行神经行为学、四肢协调性及学习记忆能力检查;术后第14天处死大鼠取脑组织进行四氮唑红(T TC)染色鉴定模型的成功与否。对照组不进行动脉阻塞。结果  术后1 h至第14天, MCAO 大鼠与对照组比较,在神经行为学、协调性及学习记忆能力等方面均有明显的缺失和障碍( P< 0101) 。结论  采用插线法制作的大鼠短暂脑缺血模型操作简单;术后动物行为学实验是1种半定量分析,具有敏感、客观的特点,能够广泛应用于各种实验研究。

关键词: 大脑中动脉阻塞; 短暂脑缺血; 行为学; Y迷宫实验

缺血性脑血管病约占所有脑血管病的70 % ,与其他脑血管病相比,具有“三高一低”的特点,即高发病率、高致残率、高复发率、低死亡率。我国每年新发病人数120万～150万,几乎所有的病例均遗留不同程度的残疾。从经济学、社会学角度考虑,缺血性脑血管病对人类的威胁较其他类型的脑血管病更大。因此,对缺血性脑血管病而言,迫切需要寻找合理有效的治疗措施。目前,对于神经细胞凋亡的研究多数来源于广泛或局部脑缺血的动物模型,此模型的病理改变同人类的脑中风相类似,是一种较为成熟的动物模型,被广泛应用于各种实验研究中。通过对大脑中动脉的有效阻塞后的再灌注,使脑中特定部位发生坏死和凋亡。

本实验试图通过建立缺血2 h的大鼠短暂脑缺血模型,从大鼠的行为学表现和学习记忆能力两方面对该模型作出评价,从而为进一步的治疗效果提供合理的评价依据。

1 材料与方法

111 材料

雌性SD大鼠24只,体质量250～300g ,由中国科学院上海实验动物中心提供。随机分为2组: MCAO 大鼠12只,对照组12只。对照组只做手术但不插线栓塞血管。112 制备大鼠左侧大脑中动脉栓塞模型大鼠用10 %水合氯醛麻醉(013 ml/ 100g) ,仰卧位取颈部正中切口,暴露颈总动脉、颈内动脉 、颈外动脉和翼腭动脉 。距颈总动脉分叉部10 mm处将颈外动脉用3 - 0丝线结扎;用3个动脉夹分别夹闭颈总动脉、颈内动脉和翼腭动脉。用1 ml注射器在颈外动脉上刺1个小孔(在颈外动脉结扎处至颈总动脉分叉部之间) ,用30 mm长、4 - 0尼龙线(尖端烧成圆形,以免刺破血管内壁)经此小孔插入,松开颈内动脉上的动脉夹,将插线经颈总动脉分叉处插入颈内动脉直至堵塞住大脑中动脉(从颈总动脉分叉处插入线长18～20 mm) 。90 min后,拔出插线。近心端结扎颈外动脉,松开颈总动脉和翼腭动脉上的动脉夹,肉眼可见血管内血流恢复。分层缝合手术切口,注意动物保暖。

113 行为学实验

11311 神经行为学检查:神经学缺失于大鼠缺血和再灌注后不同的时间段进行。具体时间为缺血后再灌注6 h , 1、2、3、7、10、14 d。2组大鼠随机取6只,神经学检查标准按照Lo nga等提出的进行评分: 0 分为正常; 1 分为栓塞动脉对侧上肢不能完全伸展,而同侧上肢正常; 2 分为栓塞动脉对侧上肢屈曲,向对侧推时抵抗力下降,没有旋转; 3 分为栓塞动脉对侧上肢屈曲,向对侧推时抵抗力下降,行走时向对侧有轻度旋转; 4 分表现为行走时向对侧有严重旋转; 5 分为大鼠身体倒向梗死对侧。

11312 攀绳实验:本实验主要检查大鼠双前肢和双后肢的协调配合能力。实验于手术后2、3、7、10、14 d后进行。为完成实验,大鼠需要具有运动学习的能力。取直径115 cm的麻绳从高1 m、长和宽分别为1 5、5 0 cm的平台上垂下,手术前1 d训练每只大鼠,使之能够爬到绳子的上1/ 3。

从术后第2天开始,每个测试日测试3次。评分的标准如下: 0 分,不需任何刺激在10 s内爬上平台; 1 分,不需任何刺激在15 s内爬上平台; 2分,刺激次数小于5次,在30 s内爬上平台; 3分,刺激次数小于5次,在60 s内爬上平台; 4分,刺激次数大于5次,在60 s内爬上平台或是刺激小于5次,但爬上平台时间超过60 s ; 5分,大鼠不能爬上平台。

11313 Y迷宫学习记忆训练及测试:动物分为3组, A、B 2组随机取3只大鼠,另取3只同样规格的正常大鼠作为对照。分别于手术后第3、4、1 4天 进 行 试 验 。Y型 电 迷 宫 臂 长3 0 cm ,高1 5 cm ,宽1 5 cm。每臂末端有1 5 W信号灯示安全区,箱底铜栅间隔4 mm。电流强度017 mA ,选用电压38 V ,电击延时2 s。设一臂为起步区,按 Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ臂顺序轮流作为安全区。大鼠在起步区静置3 min ,予以电击致其逃至安全区,灯光持续15 s ,然后熄灯休息45 s ,开始下一次操作。学习训练及测试:规定大鼠受电击后从起步区直接逃至安全区为“正确反应”,以达到连续10次电击均为正确反应(即10/ 10)前所需的电击次数(即尝试次数)表示其学习获得能力(acquisi2tio n)。若尝试次数超过30次则不再测试,并以30次为最大值计数。记忆再现(ret rieval)测试:选上述达到10/ 10标准的大鼠,休息24 h后再次同法测试,以达10/10标准前的尝试次数表示记忆再现能力。

114 TTC染色

大鼠MCAO手术第14天, A、B组分别随机取6只动物,用水合氯醛过量麻醉处死(500 mg/ k腹腔注射) ,经心脏灌注生理盐水。在大脑耳间线前1 2 mm(为 额 叶 皮 质 的 感 觉 和 运 动 区) 至510 mm(为海马中部)处切成脑片,片厚1 mm ,然后将脑片放入4 %四氮唑红(2 , 3 , 5Ot rip henyltet razoliumchloride , T TC)磷酸盐缓冲液中,3 7 ℃避光孵育30 min ,取出置于10 %多聚甲醛液中固定,拍照。

2 结  果

211 鼠术后神经行为学评分术后1h至第14天MCAO组大鼠和对照组大鼠的行为学表现相比较, 对照组明显好于MCAO组 。2者 在 多 个 时 间 段 都 有 显 著 差 异( P< 0101) , 随着术后时间的推移,手术组大鼠的症状有所改善,但评分始终在2分以上,明显存在不可逆的神经行为学损伤212 攀绳实验结果术后第2～14天MCAO组大鼠和对照组大鼠的行为学表现相比较,对照组明显好于MCAO组。2者在多个时间段都有显著行差异( P <0101) , 随着术后时间的推移, MCAO 组大鼠的症状有所改善,但评分始终在3分以上,明显存在不可逆的神经行为学损伤(图2) 。

213 Y迷宫试验

Y迷宫测试结果显示, MCAO 组大鼠在各个时间段在学习记忆能力方面均明显低于对照组

( P < 0101)。

214 T TC染色的结果大鼠术后第14天, T TC 染色的结果显示:MCAO组大鼠的脑组织梗死灶明显,对照组脑组织没有明显梗死灶(图4) 。

3 讨  论

本实验通过插线法制作大鼠短暂脑缺血模型,来观察大鼠的神经行为学能力、四肢协调功能和学习记忆能力3方面的损伤情况。从术后1 h至第14天,在大鼠神经学评分、攀绳实验和Y迷宫实验中,均发现与对照组大鼠的显著性差异( P< 0101) 。尽管随着手术后时间的延长,这3项指标均有所好转,但与对照组大鼠相比,差异始终具有显著性,说明了脑损伤的不可逆性。在手术后第14天,处死大鼠进行脑组织T TC染色显示了脑梗死体积仍然较大。梗死病灶的存在是大鼠行为学功能损伤的直接证据。本实验所采用的攀绳实验曾被作为评价酒精中毒动物的行为学损伤和评价外伤性脑损伤动物的行为学改变的依据。实验动物在攀绳中的良好表现不但需要四肢的配合协调能力,而且还必须具有足够的运动学习能力。本实验中在14 d内5次进行测试,脑缺血大鼠在攀绳实验中的表现有明显的进步,而有研究证实2周或4周测试1次显示大鼠的行为学改善不明显。这表明损伤后的功能锻炼将有助于神经功能的恢复。在灵长类动物中亦有类似的报道, 合理的解释是损伤后的功能锻炼能够促进大脑皮质神经元神经突触的连接形成。目前,有关短暂局灶脑缺血对大鼠学习和记忆能力的影响报道不一。有的学者认为MCAO手术只造成脑组织纹状体和皮层的损伤,而海马组织不受影响,因此记忆能力不受影响; 有人认为大鼠脑中参与学习和记忆的部位不仅限于海马,皮层尤其是顶叶皮质在动物的学习和记忆过程中起到非常重要的作用。而MCAO手术后会造成顶叶皮层的损伤,故会导致大鼠的学习记忆能力降低。本实验中Y迷宫测试结果与对照组比较显示脑缺血大鼠的学习和记忆能力在手术后第3～14天显著降低( P < 0101) 。作者认为,除了顶叶皮质损伤影响记忆功能外,可能的原因还有大鼠脑缺血过程中伴随着大量炎性因子的释放,包括氧自由基、一氧化氮等, 这些炎性因子的扩散会造成海马组织的损伤从而影响记忆功能,但并没有造成海马组织显著的病理学改变。综上所述,本实验采用插线法制作的大鼠短暂脑缺血模型操作简单,效果可靠;术后动物行为学实验是一种半定量分析,具有敏感、客观的特点,能够广泛应用于各种实验研究。