大鼠MSCs的获得和扩增实验

实验方法原理

实验材料 大鼠骨髓

试剂、试剂盒 灭菌CCM含0.2μg ml两性霉素B(两性霉素B洗剂）纱布含100U ml青霉素100μg ml链霉素和0.2μg ml两性霉素B的PBSA无镁和钙的Hank’s平衡盐溶液（HBSS)

仪器、耗材 塑料Petri培养皿 15 cm直径装有#10和#15刀片的解剖刀1和2英尺刀刃的手术剪镊子止血钳15 cm刀刃的咬骨钳带Luer接头的注射器20ml皮下注射针 23号和18号微量离心管1.5ml和0.5ml聚丙烯离心管CO2啮齿动物安乐死小室

实验步骤

(a)CO2窒息处死动物，切勿使用药物。

(b)用酒精擦拭后肢，在不破坏股骨的情况下解剖后肢。将股骨从肢体中分出来。

(C)切除股骨上的肌肉和肌腱。用无菌纱布擦拭除去骨上的剩余组织。

(d)用酒精擦拭已清理干净的骨，将其放人50 ml塑料管中。

(e)用含抗真菌药物的冰浴CCM浸没骨，直到骨髓提取准备完毕。从分离骨到骨髓提取的时间应尽量缩短。

(f)装有股骨的离心管移至微生物安全厨中，将骨放人15 cm petri培养皿中。

(g)按如下步骤提取骨髓：用咬骨钳剪掉骨的两端，暴露内部骨髓。装有23G针头的注射器中吸人5ml含抗真菌药物的CCM，向50ml离心管中冲洗每根股骨。吸取冲洗后的CCM，反复冲洗股骨3次，将其转移至15 ml离心管中。1000g离心，用1ml含抗真菌药物的CCM重悬骨髓沉淀。在15 ml离心管中将1 ml骨髓细胞悬液加入到4 ml含抗生素和抗真菌药物的新鲜PBSA中。每根股骨所得的5ml细胞悬液可混合于同一个离心管中。

(h)在l0℃1000g离心骨髓细胞10 min,用10ml含抗生素和抗真菌药物的PBSA洗涤细胞3次。

(i)最后，用5 mlCCM重悬骨髓细胞，置于冰上。