天差地别！CRISPR导致的DNA断裂后修复与理论差距巨大

　　尽管世人对CRISPR-Cas9基因编辑抱有很高期望，科学家们仍对其人体临床应用持怀疑态度。为什么呢？

　　“基因编辑非常强大，但是到目前为止还有许多问题和错误需要探索。它们的工作方式就像一个黑匣子，有许多猜想和假设，”加州大学伯克利分校分子生物学教授Jacob Corn说。“现在，我们终于有能力开始描绘这里面究竟发生了什么。”

　　已知CRISPR-Cas9在每种细胞中的成功率有所不同，这篇发表在《Nature Genetics》的新文章揭示了让CRISPR-Cas9在几乎所有细胞中都能更好地发挥作用的隐秘途径。“如果你想治疗镰状细胞性贫血，治疗成功率与用正确的基因替换原来突变的基因的效率密不可分，”加州大学伯克利分校博后研究员Chris Richardson说。“现在你从病人体内收集了100万个细胞，正确插入率是10%。如果我们能将其提高到30-40%，效果可想而知。操纵这些细胞提高插入频率的进程被称为同源定向修复（homology-directed repair）。”

　　CRISPR依赖DNA修复

　　CRISPR-Cas9是革命性的，它可以在含有成千上万基因的基因组中精确地切割指定DNA双链，伴随着切割工作的是细胞损伤修复。

　　修复一般通过两种方式：在酶的帮助下把两个悬空的末端粘合，通常这会导致1个或多个碱基的增加或删除，这会破坏基因功能；另一些酶可以用一段DNA单链匹配被剪切的DNA片段的上游和下游序列，建立互补DNA链完成双链修复。前者被称为非同源末端连接，是CRISPR切割导致的最常见情况。后者被称为同源定向修复，发生的频率似乎根据不同细胞类型具有选择性倾向。过去，研究人员试图通过额外补充一条DNA单链来增加细胞利用同源定向修复机制替换错误序列。

　　总的来说，这两个过程都有点神秘，没人知道细胞为啥“挑三拣四”。“CRISPR-Cas9对合成生物学和医学来说都是革命性的，但目前还没人知道把它放入细胞后真正会发生什么，”Richardson说。“我们只知道创建一些断口，剩下的依靠细胞自己修复它们，我们并没有真正理解过这一过程是如何运作的。”

　　为了找出哪种DNA修复酶在CRISPR切割后的同源定向修复中起主导作用，Richardson和同事采用了CRISPR干扰技术（CRISPRi），逐个敲除健康细胞的超过2000个已知或疑似参与了DNA修复的基因。

　　令人惊讶的是，许多已知的对同源定向修复比较重要的基因实际上竟然参与的是其他修复系统——

　　这条途径涉及了21个独立的蛋白质，人称范康尼贫血（Fanconi anemia）途径，因为这条途径上任何蛋白编码基因突变都会导致范康尼贫血症，这是一种罕见的严重遗传性疾病，患者骨髓不能生产足够的新血细胞。这种出生缺陷还与生命后期的癌症高风险有关，童年时期患白血病的风险高达10%，很少有病人活过30岁。

　　这条途径实际上已被科学家们认识几十年了，它被理解为专门用于修复特定DNA损伤：DNA链间交联（DNA interstrand crosslinks），其中一条DNA链的核苷酸与相邻链的核苷酸紧密结合，干扰DNA复制，对细胞来说通常是致命的。

　　20世纪80年代曾有科研人员报道过同源定向修复与范康尼贫血途径之间存在联系，很可惜，这些发现一直被忽视或误解了。

　　“根据我们的研究，范康尼贫血途径在修复其他损伤中也扮演重要角色，我们最好将它视为能修复双链断裂的一种途径，”Richardson说。“在Cas9编辑后，如果你想顺利插入新DNA，范康尼贫血途径是必须的。”

　　范康尼贫血途径在修复CRISPR断裂中的重要性使科学家们开始怀疑一些CRISPR疾病治疗方案：如果范康尼贫血途径缺乏活力，这些细胞就无法顺利完成用新基因替换突变基因的任务。

　　事实上，范康尼贫血途径的活性水平可能影响CRISPR在特定细胞中插入DNA的效率。研究人员认为，末端连接是双链断裂后的默认修复机制，范康尼贫血途径会与之竞争，如果活性较高的话会导致同源定向修复多于末端连接修复。

　　癌症治疗

　　这些发现帮助科学家更好地理解了人类细胞中的DNA修复机制，同样，也可以帮助癌症研究学者指定更好的抗癌策略。现在，人们已经找到了其他影响双链断裂损伤修复的关键因子，我们就可以从这些薄弱的蛋白质入手，阻止癌细胞DNA修复，使它们更容易死亡。

　　Richardson发现，该途径中的FANCD2蛋白总喜欢在CRISPR-Cas9导致的双链断裂位点上驻留，这表明它可能对插入新DNA起重要作用。操纵FANCD2可以提高细胞利用同源定向修复的频率。

　　“鉴于FANCD2的定位，你可以利用它映射Cas9在任何细胞类型中的切割位置，”Richardson说。“如果你正在编辑一群细胞，你肯定很想知道你的目标切割位点在哪，如今，你只需在基因组中找到FANCD2，你就可以找到那些切割位点。”

　　“由21种蛋白质构成的范康尼贫血途径影响着末端连接和同源定向修复之间的平衡，它就像一个交警，换句话说，患者的基因型将直接影响你应该如何对Ta进行基因编辑，”Corn说。