太赞了！质粒提取鉴定及保存

（1） 质粒的提取 (Tiangen质粒提取试剂盒)：

a） 挑菌： 选取培养板中大小中等的单个菌落， 消毒牙签接种到10ml摇菌管中， 其中含有卡那霉素的LB约5ml， 37 °C， 220rpm恒温摇床中震荡培养过夜。

b） 取上述2.0ml培养液， 于常温下12000 rpm离心1分钟， 弃上清， 干燥沉淀。

c） 加入250µl溶液P1(配有去RNA酶， 4 °C保存)， 涡旋振荡， 完全悬浮细菌，不能留有沉淀， 否则会影响裂解。

d） 加入250µl溶液P2， 快速上下颠倒8次， 常温静置3分钟， 可见混合液逐渐变清、 粘稠， 表示已充分裂解。

e） 再加入350 µl溶液Ⅲ， 快速上下颠倒8次， 可见白色絮状物出现。

f） 常温12000rpm离心10分钟， 所得上清液倒入已经用BL平衡过的过滤柱中，注意不要倒入白色絮状物沉淀， 静置3分钟， 12000 rpm离心1分钟。

g） 加入500 µl溶液PD， 12000 rpm离心1分钟。

h） 加入600 µl溶液PW， 12000 rpm离心1分钟； 此步骤再重复1次； 弃废液后空管再次12000 rpm离心2分钟。

i） 于超净台通风干燥， 放置2-5分钟， 加入33µl已加热至65 °C的已灭菌的ddH 2 O， 室温静置3分钟， 12000 rpm离心2分钟， 得到相关质粒DNA， 测浓度， -20 °C保存备用。

（2） 质粒鉴定及保存

取100ng上述提取的质粒， 进行酶切（反应体系见前）， 随后用0.8%琼脂糖凝胶电泳以鉴定（方法同前所述）， 最后将粗略鉴定正确的样本送至生物技术公司测序。 如测序正确， 用50%灭菌甘油300µl+700µl的菌液， 标记于-80 °C保存备用。

11） 质粒或PCR产物纯化（胶回收）

（1） 琼脂糖电泳酶切或 PCR 相关产物。

（2） 在紫外投射反射仪割取含有目的片段的琼脂糖凝胶片段， 割取要迅速， 以避免紫外线对 DNA 的损伤， 但注意尽量割取目的片段， 减少无目的片段的凝胶量， 以便提高纯化回收效率。

（3） 用天平称先称区空 EP 管重量， 再称取含有凝胶的 EP 管重量， 计算得到凝胶重量（mg）， 加入等量体积（µl） Bindingbuffer（如 1 mg=1 μl）。

（4） 将含有凝胶的 EP 管置入 60 °C 恒温水浴箱中融化凝胶， 持续 8-10min，间或拿出摇匀， 以确保完全凝胶溶解。

（5） 将上述凝胶溶液转移至干净的纯化柱上， 室温下静置吸附 3 分钟。

（6） 将纯化柱 12000rpm 离心 1 分钟， 弃超滤液， 必要时可将超滤液重新离心1 次可提供纯化效率； 再次加入 100µl Binding buffer， 12000rpm 离心 1 分钟。

（7）加入 700µl Wash buffer （事先已经加入无水乙醇）， 12000 rpm 离心 1 分钟，弃超滤液； 空管 12000 rpm 离心 2 分钟。

（8） 纯化柱置于 1.5 毫升干净离心管中， 于超净台通风干燥 5 分钟。

（9） 加入 30µl 已加热至 65 °C 的已灭菌的 ddH 2 O， 室温静置 3 分钟， 12000 rpm离心 2 分钟， 得到相应的 DNA 片段， 测浓度， -20 °C 保存备用。