一、有关产品固相载体
可作酶联免疫吸附剂测定中载体的物质很多,例如:聚苯乙烯、聚氯乙烯、以含铁的磁性微粒制作的、还有微孔滤膜,如硝酸纤维素膜、尼龙膜等。
最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能,抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料,可制成各种形式。在酶联免疫吸附剂测定测定过程中,它作为载体和容器,不参与化学反应,所以被普遍采用。
酶联免疫吸附剂测定载体的形状主要有三种:小试管、小珠和微量反应板。最常用的载体为微量反应板。良好的酶联免疫吸附剂测定板应该是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之间和同一板各孔之间性能相近。
二、抗原和抗体
在酶联免疫吸附剂测定实施过程中,抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。
联免疫吸附剂测定所用抗原有三个来源:天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物等,一般含有多种抗原成分,需经纯化,提取出特定的抗原成分后才可应用,因此也称提纯抗原。重组抗原和多肽抗原均为人工合成品,使用安全,而且纯度高,干扰物质少。
用于酶联免疫吸附剂测定的抗体有多克隆的和单克隆的。
三、免疫吸附剂
固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被。由于载体的不同,包被的方法也不同。包被好的酶联免疫吸附剂测定板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。
四、酶和底物
酶联免疫吸附剂测定中所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定,继续保留着它的活性部分和催化能力。酶联免疫吸附剂测定中最常用的酶为辣根过氧化酶(HRP)
五、结合物
酶标记的抗原或抗体称为结合物。抗原由于化学结构不同,可用不同的方法与酶结合。如为蛋白质抗原,基本上可参考抗体酶标记的方法。
1.戊二醛交联法戊二醛是一种双功能团试剂,可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法(如连接AP),也可用二步法(如连接HRP)。
2. 过碘酸盐氧化法本法只用于HRP的交联。该酶含18%碳水化合物,过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基。用硼氢化钠(NaBH4)中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼,可与蛋白质结合,形成按摩尔比例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化物酶交联最有效的方法。但也有只认为由于所用试剂较为剧烈,各批实验结果不易重复。