如何对某个微生物菌种进行实时定量pcr

Real2time PCR)技术 ,是在 PCR反应体系中加入荧光基团 ,利用荧光信号累积实时监测整个 PCR进程 ,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术于 1996年由美国 AppliedBiosystems公司推出 ,通过对 PCR过程的实时监控 ,可专一、 灵敏、 快速、 可重复地精确定量起始模板浓度 ,真正实现了 PCR从定性到定量的飞跃。荧光定量 PCR技术以其独特的优势得到快速发展 ,这项技术已经广泛应用于临床和生命科学研究的各个领域。现就其在临床微生物检测方面作一概述。1　 荧光定量 PCR在检测和鉴定中的应用1 . 1　 在病毒检测和鉴定中的应用目前 ,荧光定量 PCR已用于多种病毒的检测。Malmstrom等术对 185份不同基因型混合到一起的 B型肝炎病毒样本进行检测 ,能检测到所有的基因型 ,以此证明该方法的高精确度。OkamotoTaqMan技术平台。雷永良等对 172例临床诊断手足口病患者的 324份标本进行人肠道病毒、 柯萨奇病毒 A组 16型和肠道病毒 EV71型核酸特异性的反转录检测 ,同时进行荧光定量 PCR和 EL ISA法平行检测 ,荧光定量 PCR方法的结果与反转录检测一致 ,两者的灵敏度均高于 EL ISA法 ,与传统的 RT2PCR和 EL ISA相比 ,实时荧光定量 PCR检测标本快捷 ,特异性强、 灵敏度高 ,检测手足口病肠道病毒准确高效 ,值得推广。秦萌等定量 RT2PCR 检测方法 ,实现了同时检测新甲型[1]采用四重 TaqMan荧光定量 PCR技[2]建立了风疹病毒的[3 ]设计的一种四重荧光 2011年 第 2期李春娟等 :荧光定量 PCR技术在临床微生物检测中的应用H1N1流感病毒、 人季节性 H1N1流感病毒和人季节性 H3N2流感病毒 ,该方法特异性强 ,灵敏度高 ,最低可检测至 20个拷贝的 RNA。谭耀驹等[4]以人 3型腺病毒感染的细胞和常见的呼吸道消化道感染的病原体为研究对象 ,建立了人 3型腺病毒 TaqMan荧光定量 PCR检测方法 , TCI D50细胞培养液中病毒核酸最低检出稀释度是 1026,且呼吸道和消化道感染常见的病原体未出现交叉反应。白志军登革热病毒 (DV) 1型 5′设计一套特异性引物和 TaqMan探针进行荧光定量PCR快速监测并应用于临床诊断 ,在登革热的早期诊断中有较高的敏感性、 特异性和重复性 ,可作为DV1的快速诊断方法。其他病毒如 A /C/E型肝炎病毒 DNA[2]、 EB 病毒[13 ]等荧光定量方法均有报道和建立。WHO 于2009年 4月 28日起草了 CDC protocol of Real2timeRT2PCR for influenza A (H1N1) ,详细介绍了 TaqMan技术进行猪流感病毒检测和分型的操作规程1 . 2　 在细菌检测和鉴定中的应用近年来 ,由于传统方法鉴别细菌的种种不足 ,Real2time PCR 技术已应用于多种细菌的检测。Chandran等了检测结合分枝杆菌的方法 ,与传统的涂片染色法和培养法相比 , 其灵敏度为 97. 2% , 特异性达100% ,均高于两种传统方法。Tatavarthy等沙门氏菌的 ompF基因进行 Real2time PCR技术检测 ,此方法能检测沙门氏菌属的所有种型 ,特异性为100%。