如何根据实验目的选择流式细胞仪

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自七十年代出现第一代流式细胞仪以来，随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光 素合成技术的不断发展，现代流式细胞仪已今非昔比，制造工艺、功能、精确度有了质的飞跃。

流式细胞仪 生产厂商推出各种不同型号的流式细胞仪来满足用户的不同需要。现生产流式细胞的厂商全球至少有六家，各厂商产品又有不同的系列，各具特点。如何从众多的型号中挑选出最适合自己的机型，我们还需从分析应用出发，评估自己的需求来决定什么样的流式细胞仪最具性价比、最适合自己。

一、DNA 倍体分析

DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。

流式细胞仪要求：488nm光源，575nm滤光片。

二、细胞生存能力实验

使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。

流式细胞仪要求：360nm光源，455nm滤光片

三、计数外周血中检测网织红细胞

使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的性价比。

流式细胞仪要求：488nm光源，525nm滤光片，液量绝对计数系统

四、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定

使用标准ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE标记CD34抗体，PE-CY5标记CD45抗体。

流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统

五、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验

检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义，因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。

流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片

六、血小板自身抗体检测

血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。

流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片

七、移植交叉配型

原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。

仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片

八、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应

淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。

流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm滤光片

九、检测细胞内因子(TH1/TH2细胞检测)

未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少,用流式细胞仪很难检测出来,因此在检测前需刺激活化.活化所用的刺激素为PMA 佛波酯+Ionomycin.淋巴细胞在刺激素的作用下,活化分泌细胞因子到细胞外.因流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测,如细胞因子分泌到细胞外则检测不到,因此必须阻止细胞因子的分泌.抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A或Monensin.Th1/Th2细胞首先是CD4+T细胞,因此存在着用CD4来设定细胞群的问题.我们知道CD4不但在T 细胞上表达,还在所有的单核细胞上表达,因此单独用CD4设门无法将CD4+T细胞区分开来.那么我们用CD3和CD4双参数设门是否可以呢?回答是否定的.因为在佛波酯的刺激作用下CD4 抗原的表达会迅速下调,甚至完全丧失,所以不适合于设门.用CD3和CD8设门,因CD8不受佛波脂的影响且绝大多数CD3+CD8-的细胞都是CD3+CD4+细胞,因此可用CD3+CD8-细胞群来确定CD4+T细胞群.FITC标记CD8,PE标记IL-4和,PE-CY5标记IFN-r,APC或PE-CY7标记CD3.

流式细胞仪要求：488nm或633nm(仅限APC染料)光源,525nm、575nm、675nm,767nm滤光片.

十、细胞增殖状态检测

核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况,在评估肿瘤预后有重要意义.为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测.FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd,PE或(并)PE-CY5标记细胞表面标志物.

流式细胞仪要求：488nm或633nm光源,525nm、575nm、675nm滤光片.

十一、染色体分析

流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料：Hoechest33258与核苷酸AT结合;Chromomycin A3与GC相结合.从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体.平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验,而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体,如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析.

流式细胞仪要求：360nm或488nm光源,450nm、580nm滤光片.

十二、BrdUrd标记追踪细胞分化

通过细胞分化时涉入溴化尿嘧啶,再使用抗BrdUrd抗体及PI核酸染料可精确识别它们.在流式细胞仪上可清楚地识别出处于G1、S、G2、M期的细胞,在肿瘤研究中有着重要作用.

流式细胞仪要求： 488nm光源,525nm、575nm滤光片.

十三、淋巴细胞亚群分析

外周血CD3、CD4、CD8、CD19、NK等各类淋巴细胞亚群定量分析.

流式细胞仪要求： 488nm光源,525nm、575nm滤光片,液量绝对计数系统.

十四、白血病免疫分型

CD45设门三色白血病免疫分型.

流式细胞仪要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm滤光片.最少三色荧光,参数越多检测越为灵敏.

十五、血小板分析

血小板活化实验、血小板功能分析.血小板识别抗体及相应活化指标.

流式细胞仪要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm滤光片,液量绝对计数系统.

十六、白血病、淋巴瘤微小残留病灶检测

根据初诊免疫分型结果,多参数联合设门检测是否有残留白血病细胞,监测白血病的复发.

T系白血病微小残留病灶检测

流式细胞仪要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm滤光片,液量绝对计数系统.

B系白血病微小残留病灶检测,液量绝对计数系统

流式细胞仪要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm滤光片.最少三色荧光,参数越多检测越为灵敏.

髓系白血病微小残留病灶检测,液量绝对计数系统

流式细胞仪要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm滤光片.最少三色荧光,参数越多检测越为灵敏.

十七、细胞凋亡分析

DNA凋亡峰检测、ANNEXIN-V/PI双染法凋亡检测.

流式细胞仪要求： 488nm光源,525nm、575nm滤光片.

十八、肿瘤耐药分析

P-gp、LRP、MRP、BCRP各类耐药蛋白表达及功能检测.

流式细胞仪要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm滤光片.

十九、强直性脊柱炎诊断

检测淋巴细胞B27表达强度及百分比,诊断强直性脊柱炎.

流式细胞仪要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm滤光片.

二十、PNH诊断

外周血或骨髓检测淋巴细胞、粒细胞、红细胞或单核细胞CD55、CD59表达强度或百分比,确诊夜间阵发性血红蛋白尿.

流式细胞仪要求： 488nm光源,525nm、575nm、675nm滤光片.