如何鉴定转基因成分？

　　转基因生物（Genetically Modified Organism，简称 GMO），是利用现代分子生物学技术改变基因组构成的生物，而非传统的选择育种，一般包括转基因植物、 动物和微生物。转基因食品就是利用上述的转基因生物（包括植物、动物和微生物）加工而成的食品或食品添加剂。目前最受关注的绝大多数转基因食品都来源于转基因植物。

　　2014年5月27日，农业部即下发通知要求加强农业转基因生物安全监管，全面部署进一步加强农业转基因生物安全监管工作。农业转基因生物安全监管工作事关粮食安全、食品安全和生态安全。农业部高度重视，不断健全制度，强化监管。

　　《中共中央国务院关于落实发展新理念加快农业现代化实现全面小康目标的若干意见》中指出：强化现代农业科技创新推广体系建设。加强农业转基因技术研发和监管，在确保安全的基础上慎重推广。《中共中央国务院关于积极发展现代农业扎实推进社会主义新农村建设的若干意见》中强调：严格执行转基因食品、液态奶等农产品标识制度。启动实施农产品质量安全检验检测体系建设规划。

　　转基因成分鉴定整体方案包括：QuantStudio系列实时荧光定量PCR平台和QuantStudio 3D芯片式数字PCR平台用于快速筛查和检测， 3130/3500/3730/SeqStudio系列基因分析平台和Ion Torrent高通量测序平台用于验证和确认。

　　不同平台的具体应用和特点：

　　1、QuantStudio系列实时荧光定量PCR平台

　　对于 GMO 的检测，目前最常用的是 qPCR 方法。筛选检测为检测通用的启动 子与终止子序列，特异性品系检测为检测编码区域序列。对于未知的品系，需先对编码区进行测序，然后设计特异的引物探针进行检测。为了避免假阳性，可通过对 PCR 产物测序而进行最终的确认。

　　普通的单重荧光定量PCR检测存在实验成本高，多靶点检测操作复杂的问题，而多重荧光定量PCR又存在各项检测彼此干扰，实验条件难优化的难题。所以，常规的荧光定量PCR技术并不适合对复杂的转基因作物进行高通量的筛查与检测。TaqMan微流体荧光定量PCR芯片技术，采用Quant Studio 7 Flex实时荧光定量PCR平台运行，是一种简单、快速、灵敏、准确、有效的方法，可以同时对多个转基因样品，多个转基因靶点进行高通量的检测。

　　TaqMan微流体荧光定量PCR芯片技术的应用实例——转基因玉米检测

　　在这项实验中，在实现转基因样品多样品、多靶点高通量筛查的同时，有效地克服了PCR扩增效率低下，手工操作步骤多所带来的高错误率等问题。

　　18种玉米转基因标准物质通过商业渠道获得(American Oil Chemists Society及Sigma/Aldrich, China)。16个真实玉米转基因样品来源于日常检测所收集的阳性样品，包括玉米粉、玉米粒、玉米膨化粉和玉米酒精糟可溶物。

　　将玉米的两个内源基因(hmg和ADH基因)，一个内部上样质控基因(18S基因)及18个外源重组靶点(TC1507，NK603，MON87640，MON863，MON810，MIR162，LY038，GA21，DAS40278，BT176，BT11，98140，59122，3272，MON89034，MIR604，MON88017和T25)共21种不同的引物和探针组合预先包埋在TaqMan微流体芯片上，对每个项目进行单重荧光定量PCR反应与检测。芯片可一次检测7个样品及一个阴性对照，或6个样品和1个阳性对照及1个阴性对照。

　　• 灵敏度：18种转基因品系的检测灵敏度都能达到1%，而其中12个转基因品系的灵敏度能够达到0.1%。

　　• 特异性：18种转基因品系都能特异性检出。

　　• 针对16个真实的玉米转基因样品，利用TaqMan微流体芯片的检测结果与常规荧光定量PCR检测结果进行比较，所有受试样品的芯片检测结果与常规荧光定量PCR的检测结果完全一致。

　　2、QuantStudio 3D芯片式数字PCR平台

　　2017年2月28日发布，2017年9月1日实施的国标GB/T 33526-2017“转基因植物产品数字PCR检测方法”中规定了转基因成分检测的数字PCR方法，适用于玉米、大豆、油菜、水稻、马铃薯、苜蓿、棉花等转基因植物及其产品的转基因成分数字PCR检测，所能达到的检测低限为0.1%。国标中指出，数字PCR其技术原理是通过将原始PCR反应体系进行分割，进而对所有小的反应体系进行扩增并后续检测。通过对反应体系进行有限的分割，从而使整个反应体系可以更加耐受核酸抑制因子，并且更加稳定、准确、快速地对痕量的转基因成分进行精准鉴定。其中芯片式数字PCR通过微流控芯片实现对原始反应体系的分割，这种分割方式具有稳定性好、均一性好的优点。QuantStudio™ 3D Digital PCR系统采用芯片式数字PCR原理，能够简洁、快速、准确地完成转基因的检测和定量。

　　QuantStudio 3D芯片式数字PCR的应用实例——转基因大米检测

　　在这项实验中，一张芯片完成了转基因元件和内源基因的双重PCR反应以及定量，且检出了万分之一数量级的转基因成分。QuantStudio 3D数字PCR系统可以从大量非转基因的基因组里检测出混杂的极低含量的外源基因。在这项实验中按照质量百分比在非转基因大米中混入了2%和0.01%的转基因大米。取一定量大米研磨成粉状后，使用专门针对植物样本核酸提取的磁珠法试剂盒进行核酸提取。之后进行数字PCR实验。这项实验中同时检测了FAM荧光标记的植物基因工程中常用的胭脂碱合成酶终止子外源基因(NOS)，以及HEX标记的水稻的内源基因磷脂酶D基因(PLD)。结果显示该样品的转基因拷贝数占总基因组的实际检测值为0.017%和3.155%。

　　传统荧光定量PCR能够进行GMO的检出和定量，但其不足也非常明显：DNA样品需要较高的品质要求，定量结果要求PCR反应的效率接近100%，标准品价格昂贵，绝对定量标准曲线的实验较繁琐，且对于低浓度的GMO混杂样品检测灵敏度不高。与之相反的是，数字PCR已被证实对DNA样品中的PCR抑制物不敏感，而且对于低浓度的样品定量也非常准确。这使得数字PCR在GMO检测领域具有很高的实际应用价值。基于QuantStudio 3D的GMO检测和定量技术在服务于GMO研究、检测以及监管的各级机构正在获得越来越广泛的应用。

　　3、3130/ 3500/ 3730/ SeqStudio系列基因分析平台

　　为了避免PCR结果的假阳性，可通过对 PCR 产物测序而进行最终的确认。应用3130/ 3500/ 3730/ SeqStudio系列基因分析平台，可进行针对转基因目标序列的的金标准测序，对转基因成分进行准确验证。

　　基因分析平台的应用实例——水稻转基因系的确认

　　香稻因其香味宜人而备受世界青睐。一个编码甜菜碱醛脱氢酶（BADH2）的badh2等位基因的缺陷的存在导致2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)的合成，它是一个主要的香气化合物。在这里，转录因子效应的核酸酶（TALENs）通过转基因的方法靶向并破坏OsBADH2基因。从20个转基因潮霉素抗性株系中恢复了六个杂合突变体（30%）。通过Sanger测序法确认了这些株系在TALEN靶点有各种各样的插入缺失突变。同样通过Sanger测序法确认了所有这六个株系都将BADH2基因突变传递至了T1代；四个T1代突变系也有效的将突变传递到T2代。这些结果表明通过转基因的方式使用TALENs进行定向诱变是一种创造重要农艺性状的有用方法。

　　4、Ion Torrent高通量测序平台

　　为了避免PCR结果的假阳性，可通过对 PCR 产物测序而进行最终的确认。应用Ion Torrent高通量测序平台，利用靶向基因组测序数据可以进行转基因目标序列的快速鉴定和确认。