定制40bp寡核苷酸实验

1. 制出正义链（top strand)。TRAFIG 程序可以在没有基因要翻译的情况下被运行，但可以指定输出为 40bp 长、度的线性链。这就可以很方便地提供一个设计序列的正义链的列表，它按 40bp 的线性链排序。如此每一个线性链都可以被标上一个名字或者编号，从而方便地以 E-mail 的形式从销售商那里定制。少于 40bp 的最后的一段则没有定购。

2. 制出反义链。OTHSTR 程序用来生成互补链，因为这两条链对于组装都是需要定制的。在运行 TRAF1 G 程序产生 40bp 每段的反义链之前，必须注意的是（要删除开头的少量碱基），输出的结果要正好是从正义链图谱右侧的第 20bp 开始（定制的第一段线性链要正好在正义链的最后一段寡核苷酸的第 21 个核苷酸处终止）。目的是在整个基因的组装中精确建立 20:20 的重叠，如同 Stemmer 等（1995) 所描述的。如果制出的图谱从右边开始，那么最后一段线性链就只有 20 碱基。这 20bp 的寡核苷酸同样也没有定制。

3. 定制一个“touch-up”寡核苷酸。有可能所希望获得的基因在长度上并非那么恰好(40n+20)，所以需要定制一个额外的补偿性的 40bp 的寡核苷酸以代替在反义链定相的起始位点处漏去的一些碱基，它还超出基因少量碱基对。这个额外的寡核苷酸比反义链的右侧是要多余超过 20 个碱基，但是，“touch-up”寡核苷酸将作为模板参与组装过程，并通过超出基因的这些必要的少量碱基对来延伸基因，因为这些碱基与该侧的 PCR 引物具有同源性 (参见图 33-4)。事实上，只要重叠区至少达到 20bp，“touch-up”寡核苷酸在任一边都可以做（正义链在左側，反义链在右侧），以改变或调整所希望得到的人工基因的边缘。



4. 可以定制标准长度的（约 25bp)PCR 引物以引导扩增反应。或者，依赖于所采用的克隆策略，如果第一个和最后一个 40bp 的寡核苷酸在反应中作为全长使用时（200nmol/L)，它们可以直接用作 PCR 引物。