定量蛋白质组学方法获得了泛素化分布和动态变化信息的介绍

泛素化是真核生物特有的翻译后修饰，在哺乳动物细胞中，泛素化靶向∼100,000 个位点，并由约640种泛素化酶和约90种去泛素化酶可逆调控。尽管目前泛素化已被广泛关注和研究，但对蛋白质特定位点的泛素化比例（占有率）进行量化的研究却很少。因此本文主要通过定量蛋白质组学方法，量化了人类细胞中蛋白质组范围内的泛素化位点占有率和泛素化修饰的半衰期。

为了系统地量化泛素化的位点特异性占有率，作者采用了连续稀释SILAC（Serial Dilution SILAC, SD-SILAC）的方法对HeLa细胞进行定量。该方法的原理如下：泛素化修饰的蛋白在trypsin酶切后会余下Lysine侧链（ε-氨基）-Glycine-Glycine的残留修饰，该修饰可以通过抗体富集并被串联质谱检测鉴定。基于该机制作者首先对轻重标SILAC细胞分别用NHS-GG-Boc标记lysine侧链，其中H为低浓度的部分化学修饰（Partial Chemical modification，PC-GG），L为高浓度的全局性化学修饰（Comprehensive Chemical modification，CC-GG），通过在H组中掺入已知比例的L组，并对抗体富集Lysine-ε-Glycine-Glycine后的混合蛋白质组进行标记，即可获得准确的PC-GG值；随后在第二步定量中，作者在天然的未标记L蛋白质组中掺入已知比例的PC-GG H蛋白质组，trypsin酶切抗体富集后利用第一步的PC-GG值和第二次定量的H/L ratio即可获得位点的天然泛素化占有率。

通过上述实验，作者定量到了上万个泛素化位点，并得知细胞中天然泛素化位点占有率的中位数仅0.0081%，作者还将该比例与细胞中其他翻译后修饰进行比较，发现泛素化修饰水平比磷酸化等高修饰率的翻译后修饰低了近3个数量级。说明泛素化修饰的位点虽然很多，但其修饰率极低。作者还量化了泛素化修饰的半衰期，发现大多数泛素化修饰半衰期在30分钟以下，寿命远小于mRNA和蛋白质，说明泛素化修饰在细胞中是高度动态变化的。

随后，作者还尝试探究了去泛素化过程中蛋白酶体活性的影响，向SILAC细胞中添加靶向泛素活化酶和靶向蛋白酶体的小分子抑制剂（TAK-243和MG-132）进行定量检测，定量结果显示即使蛋白酶体活性减弱，蛋白酶体定向底物的去泛素化仍可能发生，这种解偶联允许泛素在蛋白酶体受损的细胞中循环，可能有助于维持泛素化的信号传导功能，并减轻蛋白酶体受损引起的蛋白毒性应激。最后作者对泛素化修饰位点进行GO分析，发现修饰比例较高的位点主要集中在质膜和跨膜转运蛋白中，且在同一跨膜蛋白中细胞质一侧结构域上更为集中。

总的来说，本文通过定量蛋白质组学方法，系统地获得了泛素化分布和动态变化信息，为泛素化修饰的生物功能及作用机制等研究提供了新的方向。