实体瘤的CART细胞治疗

　　简介

　　嵌合抗原受体（CAR）含有一个细胞外单链可变区（scFv），其功能为标的、穿膜间隔、及细胞内信号或激活。CAR-T细胞将CAR通过质粒转染、mRNA或病毒载体传导引入T细胞以识别细胞表面暴露的癌相关抗原（TAA）。

　　迄今为止大约有30个TAA正在研究中，其中广为关注的包括癌胚抗原（CEA）、神经节苷脂GD2，间皮素、白介素13受体α (IL-13Rα)、人表皮生长因子受体2（HER2）、成纤维细胞活化蛋白（FAP）、及L1细胞粘附分子（L1CAM）。其中较为乐观的CAR-T临床试验包括GD2 CAR-T治疗成神经细胞瘤、HER2 CAR-T治疗肉瘤、及HER1 CAR-T治疗肺癌。

　　CAR-T治疗实体瘤主要面临问题包括TAA特异性及可接触性、抗原杂合性、细胞贩运、恶劣肿瘤微环境（TME）、及T细胞内部调控通路。

　　标的抗原特异性问题

　　理想的TAA应具有肿瘤特异性与可接触性，即在所有肿瘤表面有表达，且在正常细胞中无分布。此类TAA包括新抗原、癌胚或发育抗原、及肿瘤选择抗原。表皮生长因子（EGFR）与糖蛋白为良好实体瘤标的物，如EGFR变体III（EGFRvIII）CAR-T治疗成神经细胞瘤、MUC1 CAR-T治疗乳腺癌、与MUC16 CAR-T治疗卵巢癌。选择性肿瘤抗原（TSA）如间皮素也具有潜力，目前进行的尝试包括SS1抗体及指定P4。SS1 CAR-T有造成异常免疫毒性的潜在可能性。特异性同样关系到CAR-T的安全性，如高亲和力HER2 CAR-T可能造成致命后果。控制此风险的方式包括短效转染的自限性CAR-T及自杀基因，如单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因或诱导胱天蛋白酶9（iCasp9）基因。其他增强特异性的方式还有同时识别两个抗原以增强活性。

　　抗原杂合性问题

　　抗原杂合性即为单一肿瘤内抗原表达差异，其可能通过免疫编辑造成肿瘤逃逸。解决此问题的方式为CAR-T治疗同时引导间接肿瘤杀伤，或触发“抗原扩展”。间接杀伤可通过中性粒细胞、巨噬细胞、或自然杀伤细胞接触CAR-T后释放细胞因子实现。抗原扩展可通过CAR-T在免疫刺激微环境中杀伤癌细胞，并由树突状细胞将抗原呈递给内源CD8细胞实现。EGFRvIII CAR-T治疗小鼠脑瘤后，小鼠对EGFRvIII阴性肿瘤具有抗性；间皮素CAR-T治疗间皮瘤后的患者出现新抗体反应。以上两个实验间接证明抗原扩展效应。对于抗原杂合性，目前有三种尝试：1）筛选病人TAA，并仅收治TAA表达比例高于某阈值的病人；2）同时标的多个肿瘤抗原，例如B细胞白血病治疗时将CD19及CD20同时作为靶点。标的多个抗原可以通过同一个CAR-T上表达两个CAR、使用两个CAR-T细胞株、或同一个CAR包含两个不同scFv实现；3）增强CAR-T的肿瘤杀伤力，例如T细胞受体结合后释放IL-12。然而，IL-12基因可能转移至肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中并导致严重毒性。严格控制IL-12或低毒细胞因子如I型干扰素可能缓解此问题。另一种提高CAR-T有效性的方式为释放双特异性抗体（BiTE）如抗CD3与肿瘤抗原Eph2A或CEA，其可激活内源性T细胞。

　　CAR-T细胞贩运问题

　　CAR-T细胞贩运至肿瘤细胞中遇到的困难大多由趋化因子/受体不匹配造成，如肿瘤CXCR3与CCR5配体表达量少时CAR-T细胞无法有效到达肿瘤位点。解决此问题的方式有1）使CAR-T表达配对性更好的趋化因子受体，如CCR2b可加强CAR-T在高CCL2肿瘤中的迁移，抑制CAR-T蛋白激酶A（PKA）可增强肿瘤浸润性；2）携带趋化因子的癌细胞裂解病毒可吸引CAR-T至肿瘤位点，如CCL5腺病毒载体；3）肿瘤位点局部灌注CAR-T。局部灌注的潜在问题在于技巧要求过高，且CAR-T细胞很难离开肿瘤并通过血液循环贩运至其他肿瘤位点。

　　肿瘤微环境（TME）问题

　　TME时常不利于CAR-T治疗。肿瘤周围常有物理基质及高组织压，其可通过FAP CAR-T细胞或使CAR-T分泌可降解基质的酶进行破坏。TME大多为低氧及营养饥饿状态，抑制了T细胞增殖及产生细胞因子，有时可能聚集Treg。改变关键CAR-T蛋白合成可能加强抗肿瘤活性。来源于肿瘤的可溶因子及细胞因子同样可能降低CAR-T效能，如前列腺素E2（PGE2）、腺苷、TGFβ可抑制CAR-T增殖、降低CD4活性、及破坏CD8分化。抑制CAR-T的PKA基因、系统性阻滞TGFβ、或TGFβ阴性CAR-T可增强其抗肿瘤效能。除此以外，TME中存在各种免疫抑制细胞，如Treg、髓源性抑制细胞（MDSC）、及肿瘤相关巨噬细胞（TAM）或肿瘤相关中性粒细胞（TAN），其产生的TGFβ、PGE2、活性氧/氮、及精氨酸酶降低CAR-T效能。此外，TAM可大量表达程序性死亡分子配体1（PDL1），阻滞CAR-T活动，而MDSC可能召集Treg。清除GR1阳性细胞可提高CEA CAR-T控制直肠癌肝转移能力；激活高F4/80 TAM使得CAR-T裂解卵巢癌；选择性抑制Treg强化间皮素CAR-T作用。使用IL-2可加强CAR-T作用，但同时也诱导Treg增殖，因此使用内恒性细胞因子如IL-7或IL-21对CAR-T更有效。使用具有CD28胞浆区代替41BB胞浆区的CAR时应由其注意其大量释放IL2。

　　T细胞内部调控机制问题

　　CAR-T激活时产生的表面分子如CTLA4及PD1可能对整体抗肿瘤效果有免疫拮抗作用。HER2 CAR-T或间皮素CAR-T联合PD1阻滞都有显着的肿瘤消退作用。PD1的抑制效果可通过将PD1的胞外区与CD28胞内区融合进行反转。CTLA4抗体也可提高CAR-T效能。CAR-T激活后通过一系列细胞内负反馈停止T细胞活动，包括酶（如甘油二酯激酶）、磷酸酶（如SHP1）、泛素连接酶（如Cb1-B）、及转录因子（如Ikaros）。减少上述抑制剂，如甘油二酯激酶阴性，显着增强CAR-T效能。其他限制CAR-T功能的细胞内部调控通路还有激活诱导细胞死亡，可通过使CAR-T表达抗凋亡蛋白减缓。

　　CAR-T实体瘤治疗未来方向

　　CAR-T实体瘤下一步研究方向主要为淋巴细胞清除对CAR-T的加强作用及解决实体瘤屏障。目前人们正在尝试替代CAR胞浆区，如ICOS、41BB、OX40、CD27、KIR2DS2，额外的基因编辑可为解决上述问题提供非常大的潜力。