实时荧光定量PCR

    实时荧光定量 PCR ，简称 RT-QPCR, 属于 Q-PCR 的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。荧光定量 PCR 常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法。

    SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料， 可与所有的各种序列的双链 DNA 分子结合。 在 游离状态 下，SYBR Green I 发出 微弱的荧光 ，但 一旦与双链 DNA 结合 ， 嵌入至 dsDNA， 荧光大大增强 。

    因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关， PCR 扩增不同时期中， dsDNA 含量不同， SYBR Green I 荧光信号强度不同。 可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量， 并可根据对照进行相关的计算和分析。

实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。

试剂包括：特异性 PCR 引物，新鲜提取备用的总 RNA。

使用的试剂盒有：用于合成 cDNA 第一链的罗氏试剂盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。

配套 LightCycler® 480 使用的试剂盒 LightCycler® 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各种实验组分，如 1 号管中包含热启动 Taq DNA Polymerase及反应缓冲液， dNTP mix， SYBR Green I 染料和 MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。 注意：SYBR Green I Master 需避光放置。

所需仪器与耗材有：罗氏 LightCycler® 480 全自动实时定量 PCR 仪以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。赛默飞公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 仪、单道移液器、 Nunc 冰盒及 QSP 盒装吸头等。

接下来进入实验部分，本实验操作流程是：首先用新鲜提取的 RNA 反转录合成 cDNA 第一链，然后进行实时荧光定量 PCR，其中包括： SYBR Green 反应体系的配置； PCR 程序设置； 运行 PCR 实验，样品编辑和结果分析。

首先是反转录合成 cDNA 第一链：

实验操作时注意：所有 RNA 相关的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。相关操作严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。

按照体系配方在冰上的 Rnase free 的灭菌 PCR 管中配置 Template primer mix，总体系 13μl，本实验是联合使用 anchored oligo dT 引物和随机六聚体引物进行的反转录。 先配置 NTC 对照，加入 9 号管水 10μl、 6 号管的 50mM oligo dT 引物 1μl、 5 号管的 0.6mM 随机六聚体引物 2μl，混匀。 然后进行样品一号管的体系配置， 依次加入 1μl 已调整浓度的总 RNA、 1μl oligo dT 引物、 2μl 随机六聚体引物、最后加 9μl 水补充至总体积 13μl，混匀。其他样品管，参照 1 号管的配置方法，依次加好反应体系。注意：可将总 RNA的模板量适当调整至 10ng-5μg，mRNA调整至 1-100ng。

若 RNA 样品浓度较低，则可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 来稳定模板 RNA。

将配好的反应 mix 在 PCR 仪中 65℃变性 10min，可有效减少 RNA 的二级结构。加热后迅速置于冰上骤冷，放置 5min。在反应 Template primer mix 中按体系配方顺序，依次加入以下试剂： 2 号管的 5×反转录酶 buffer， 4 号管 dNTP mix， 3 号管 40 U/μl 的 RNase 抑制剂， 1 号管 20 U/μl 的反转录酶，最终体积为 20μl。

若样品数较多，先配置反应 mix 再分装，小心吸打混合，切勿涡旋振荡。 混匀后于瞬时离心机上短暂离心，使样品和反应液落至离心管底部。将离心管放置 PCR 中，根据使用的引物以及目标 mRNA 的片段长度进行程序设置。本实验反应温度和时间设置为： 25℃， 10min， 55℃反应 30min。反应完毕后，于 85℃下加热 5min 灭活反转录酶， 再置于冰上停止反应。此反应产物可于 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更长时间。

cDNA 产物无需进行纯化即可用于后续的 PCR 反应。 20μl 的 PCR 反应体系可取 2-5μl cDNA 反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有 RNase H 活性，可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版，减少其对后续 PCR 的影响。

本部分实验，我们选用罗氏的 SYBR Green I Master 试剂盒进行基础的绝对定量分析。

本实验共设置 5 个标准样品，包含 1 个标记为 0 的空白对照， 5 个反转录样品，包含 NTC 对照，由于样品数较多，先配制不含模版的总体系，再分装为10管，加入各个样品的模板后，再将每个样品分装为 3 个复孔。

按照体系配方分别加入绿色盖子的 2×Master Mix， 10x Primer 上下游引物，PCR 级别水。 总体系配好后，在用移液枪轻柔吸打均匀，然后分装为 10 管，每管 55μl。往 10 管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的 cDNA。STD 零加入 6μl 水代替模板，其余 STD 分别加入 6μl 已经逐级稀释好的标样模板。 反转录样品分别加入 6μl 浓度调整好的模板 DNA， 包含 NTC。混匀，然后将每个样按 20μl 每孔分装至 96 孔板中。用封孔膜盖好 96 孔板，将多孔板置于合适的离心机中 1500×g 配平离心 2min 将准备好的 96 孔板放置在LightCycler® 480 设备中。

双击打开 LightCycler® 480 的 1.5 软件并登陆，自动进入软件界面，点击 new experiment,在 Detection Format 选项中选择 SYBR Green I 模式, 点击 OK 完成检测通道的设定,接下来设置反应体积，对于 96 模块，反应体系为 10μl-100μl 之间，本实验是设定 20μl 的反应体系。

在 Program Name 中输入反应名称 pre incubation，预变性设定 1 个循环，无需进行荧光的收集，执行的温度和时间设定为 95℃ 10min，视图会根据设定进行实时的调整。

点击增加按钮，输入 Amplification，定义扩增循环的次数为 45 次，并选择荧光的收集功能 Quantification，然后设定 PCR 扩增循环的温度与时间为 95℃ 10s，点击增加按钮，设定退火温度和时间为 60℃ 10s，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None，继续点击增加按钮，设置延伸温度和时间为 72℃ 20s，Acquisition Mode 选择 Single， Ramp Rate 均按自动调整值，无需再设置。

设置溶解曲线，在 Program 中的新的一行中输入 Melting Curves， 1 个循环数， Analysis Mode 选择 Melting Curves，时间和温度设置为 95℃ 5s， 点击增加按钮，新增设置温度和时间为 65℃ 1min，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None。点击增加按钮，新增设置温度为 95℃，Acquisition Mode 选择 Continuous,其他设置无需改动。

设置保温的过程 Cooling，只需 1 个循环，无需收集荧光，设定温度和时间为 40℃、 1min。设置完成后点击右边的保存按钮保存设置的程序。此时整个 PCR的循环体系、温度的设置已经设定完毕。

点击 Start run 开始运行 PCR 反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。

实验结束，点击 Sample Editor，进入样本编辑区。

Select Workflow 中选择 Abs Quant。根据样本在板中排布的方式进行样本编辑。设置阴性对照、空白对照、标准品以及未知样品等。

在 Select Sample 中，选中需要设置的样品孔。在下一栏中的 Sample Name 输入被选择样品组的名称，并在 Sample Type 中选择样品组的类型，最后点击 Make Replicates 设置复孔。标准品设置时，需填写拷贝数，只需填写好稀释倍数，初始浓度即可。 编辑好样品后，即可进行数据分析。如有需要，也可进行子集编辑。

样品编辑好后，可进行实验结果分析。

点击左边栏下方的 sum 按钮，相应出现实验的所有信息，包括：设计的反应程序，实验结果分析等。

点击 analysis，可以根据样品已有的数据进行细致准确地分析。

点击 Abs Quant second derivative max，弹出 create new analysis 窗口，在 Subset 选项中选择分析样品的分布区域，点击确定，即可出现分析图：相应样品的扩增曲线。

Standard Curve 是根据标准品得出的标准曲线，曲线左侧标有扩增效率、斜率、截距、线性关系、以及错误率。一般“Error”值越小，说明实验的准确率越高。

扩增效率如果越接近“2”，说明这次的扩增反应越好。

在数据表格，可显示单个样本的 Cp 值，以及相应的样本浓度值。

按复孔进行数据统计，显示 Cp 平均值，方差，浓度的平均值以及方差。