试剂、试剂盒 RNA 模板DNA 酶缓冲液 DNA 酶 IDEPC 处理的水oligo(dT)MgCl2 dNTPEDTA
实验步骤
—、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
①10ul 消化体系的组分。
RNA 模板（最多 1ug/10ul) xul
10XDNA 酶缓冲液 1ul
DNA 酶 I，1U/ul(Invitrogen18068-015) 1ul
DEPC 处理的水 8~xul
②20ul 反转录体系的组分。
oligo(dT)12~180.5ug/ul 0.5ul
Random Hexamer50ng/ul 0.5ul
RNA 模板（最多 1ug) xul
10X 缓冲液 2ul
(20 mmol/LTris-HCl、pH8.4，500 mmol/LKCl，25 mmol/LMgCl2)
25 mmol/LMgCl2 4ul
10mmol/LdNTP 1ul
0.1mol/L 二硫苏糖酵（DTT) 2ul
RNA 酶 OUT(40U/u1)1ul
SuuerscriutⅡ(50U/ul) 反转录系统（Invitrogen11904-018)1ul
25 mmol/LEDTA 1ul
DEPC 处理的水 补足到 20ul
二、方法
1.把上述的 10ul 消化体系混匀，25°C(室温）孵育 15 min, 然后加入 25 mmol/LEDTAlul，然后 65°C 孵育 15 min，以使 DNA 酶 I 失活。
2.每次进行 RT-PCR(20ul) 时，PCR 管应放在冰上混合各种成分。逬行多个反应时除了 RNA, 可以把所有的试剂混在一起，然后分装。反应条件：25°C 孵育10min，42°C 保持 30~50 min,70°C 再保持 15 min, 最后在冰上冷却。
3.反转录完成后，最好加入 1ulRNA 酶 H,37°C 孵育 20 min 以消化剩余的 RNA。用上面所述的Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG 反转录得到的 cDNA, 即可用作实时 PCR 的模板，也可于-20°C 保存以备将来之用。