实时PCR检测HSV2DNA的方法学评价及应用

【摘要】  目的 对本室利用Taq Man MG技术建立的HSV-2实时定量PCR法进行方法学评价及临床应用。 方法 收集60名近期有流产史妇女的全血及血清标本，分别用FQPCR和ELISA法同时检测，并进行比较；另对FQPCR从重复性、灵敏度、线性范围、特异性几方面进行方法学评价。结果 对60份临床标本检测，ELISA法的阳性率为16.7%，FQPCR法的阳性率为31.7%，明显高于前者（P<0.05)。FQPCR法的重复性较好［批内CV(变异系数)值为2.29%，批间CV值为4.76%］、线性范围好(4.75×101～106 copies/μl，r=0.998)、灵敏度达到47.5copies/μl、特异性较好（对HSV1、Vero细胞、巨细胞病毒、弓形虫等无特异性扩增）。结论 实时PCR测定HSV2方法比传统的ELISA法更快速灵敏，是较有发展前途的新技术。

【关键词】  实时定量PCR； 单纯疱疹病毒2型； 生殖器疱疹

    【Abstract】  Objective  To evaluate newly established realtime PCR method with Taq Man MG technique and apply it into clinical research Methods   Specimens from 60 women with recent abortion history were collected and detecteol with FQPCR and ELISA methods. FQPCR were evaluated on reproducibility,specificity,linear range and sensitivity. Results  The position rate of FQPCR and ELISA is 31.7% and 16.7% respectively, the former is higher than the latter(P<0.05). The assay showed good reproducibility (intraassay coefficients 2.29％ and interassay coefficients 4.76％)， good linear range (4.75×1014.75×106 copies／μl，r=0.998) ，good specificity(distinguishing HSV2 from other pathogenic microorganism) and sensitivity of 47.5 copies／μ1. Conclusion  FQPCR for detecting HSV2 is more sensitive, faster than ELISA and is a promising technique.

    【Key words】  rea1time PCR； HSV-2； genital herpes

    单纯疱疹病毒2型（herpes simplex virus,HSV-2）是引起生殖器疱疹（genital herpes,GH）的主要病原体，GH具有长期潜伏性、无法彻底治愈、病情反复发作等特点。孕妇GH还可引起胎儿宫内感染或新生儿感染，导致流产、早产、先天畸形、新生儿死亡或发生严重后遗症［1］。近年来，GH的发病率不断上升，其中部分表现不典型，甚至无症状，而及时准确地对这类感染者诊断并采取相应的防治措施可有效降低感染率［2］。

    感度不高、耗时较长等缺点。而实时荧光PCR（realtime PCR）是近几年发展较为迅速的新技术，具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点。本实验室在前期利用Taq Man MGB技术，建立一种检测HSV2的实时定量PCR，现对该方法进行临床应用及方法学评价，结果报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  主要仪器及试剂

    ELISA定量酶标仪Model550 BIORAD(美国)；实时定量PCR仪RG3000(澳大利亚)；实时PCR法定量标准品实验室自制；HSV-2 IgM ELISA KIT晶美生物；引物及探针上海基康公司设计并合成；HSV-2　SAV株购自中国疾病预防控制中心病毒研究所。

    1.2  标本

    从2004年1月至2004年6月，以广东省各大医院就诊的近期有流产史60名妇女作为研究对象，收集全血及血清两类标本，并置于-20℃保存备用。

   1.3  方法

    1.3.1  抗HSV2检测  对60例受检对象的血清样本作为样本，完全按照试剂盒说明书操作。

    1.3.2  HSV2的FQPCR定量检测  分别提取60例受检对象的全血样本DNA，用本实验室建立的实时PCR对HSV-2检测。引物及探针根据gG基因片段由上海基康公司设计并合成，分别是：FP:5′CCCCTGTTCTGGTTCCTAACG3′，RP:5′GTGGATGGTGGTGCTGATGATA3′，FAM:5′CCTGCTCTAGATATCCT 3′。实时定量PCR反应体系总体积30 μl,分别是模板DNA：2.0 μl；上游引物(5 μm)：3.6 μl；下游引物 (5 μm)：3.6 μl；荧光探针(10 mm)：0.9 ml；dNTP mixture(10 mm)：2.4 ml；Taq DNA聚合酶：0.2 ml；10×PCR Buffer：3.0 ml；MgCl2(25 mm)：6.0 ml；ddH2O：8.3 ml。反应条件：95℃ 5 min；94℃ 15 s，60℃ 60 s，30个循环。

    1.3.3  重复性  包括批内和批间重复性，批内重复性是一次对HSV-2标准毒株重复检测10次，根据测得的Ct值计算标准差(s)和CV值；批间重复性是连续10 d对同一样本进行检测，根据测得的Ct值计算s和CV值。

    1.3.4  线性范围  将标准品进行系列10倍稀释，得到4.75～4.75×108copies／μl 9个浓度。分别以每个浓度的标准品作模板进行荧光定量PCR检测，对所得荧光扩增曲线进行软件处理得到标准曲线。根据r>0.99的原则，判断方法的线性范围。

    1.3.5  灵敏度  取已制得的标准品10 μl用双蒸水稀释100倍，分别测得其在260 nm和280 nm处的吸光度，根据A260／A280判断其纯度并求得浓度为4.75×108copies／μl，再对其进行l0倍梯度稀释至4.75　copies／μl将标准品按l0倍梯度稀释至4.75 copies／μl，以每个浓度的标准品作模板进行荧光定量PCR检测，以出现典型的扩增曲线的最低病毒DNA浓度为该法的最低检测限。

    1.3.6  特异性  对HSV-2进行实时荧光定量分析，同时设定非靶DNA对照(Vero细胞、HSV-1、弓形虫、巨细胞病毒)。

2  结果　

    2.1  临床标本检测结果

    60例孕妇标本经ELISA及实时定量PCR方法检测，结果见表1。血清标本ELISA检测出10例HSV-2 IgM抗体阳性标本，阳性率为16.7％(10／60)，而实时定量PCR检测出HSV-2 DNA阳性标本有l9例，其阳性率为31.7％(19／60)。表1  ELISA与Realtime PCR检测HSV-2结果比较(略)

    2.2  重复性

    对同一标准品进行了批内及批间重复性测定，结果为：批内平均值为5.41，CV值为2.29％；批间平均值为5.46，CV值为4.76％。建立实时定量PCR检测方法具有较好的重复性。图1是批内重复性结果。

    2.3  线性范围

    标准品的浓度在4.75×101～4.75×106 copies／μl之间，标准曲线有良好的相关性(r=0.998)，见图2.

    2.4  灵敏度

    当标准品的浓度低至4.75　copies／μl时，实时定量PCR检测结果不稳定，而标准品的浓度在4.75×101～4.75×106copies／μl时，可稳定地得到扩增曲线，因此最终确定该方法的灵敏度为47.5　copies／μl。

    2.5  特异性

    实时荧光定量分析显示非靶模板的反应孔无荧光信号出现，而HSV-2呈阳性反应，表明该方法有良好的特异性。

    3  讨论　

    目前，国内应用最广泛、最成熟的实时定量PCR技术是TaqMan技术，而本实验室建立的HSV-2实时定量PCR法采用的是改良的TaqMan技术，即TaqMan MGB技术［3］。与前者相比它有两个主要的优点［2］：①探针3′ 端标记了自身不发光的淬灭荧光分子, 使荧光本底降低，荧光光谱分辨率得以大大改善，灵敏度更高。②探针3′端另外结合了MGB基团，使得探针的Tm值提高，大大增加了探针的杂交稳定性。同时也加大目标模板和非特异性带Tm值差异，特异性更高。因此本实验室采用TaqMan MGB技术建立HSV2实时定量PCR法。对本实验室建立方法的方法学评价结果显示：重复性较好，批内CV值是2.29%，批间CV值是4.76%；特异性好，只对HSV-2有特异性扩增，对HSV-1、Vero细胞、弓形虫、巨细胞病毒无扩增；线性范围好：从101到106数量级的模板都有较好相关性，r＝0.998.

    目前，临床上对该病的主要检测方法是血清学方法，对IgM抗体的检测可以反映近期是否感染，但该法存在以下缺点：病人从感染到体内IgM抗体的产生这段时间被称为“窗口期”，对这一时期的病人检测体内IgM抗体会出现假阴性结果；血清学检测是反映人体对HSV-2的免疫状态，只能间接反映体内是否存在病原体，不能真实反映感染的严重程度。而实时定量PCR是直接对体内病原体DNA检测，可真实地反映是否发生感染和病情的严重程度。在本研究中对这两种方法进行了比较，结果显示：ELISA法的阳性率为16.7%，实时定量PCR法的阳性率为31.7%，明显高于前者（P<0.05)。在实时定量PCR法检测为阳性的10例标本用ELISA法检测为阴性结果，这可能是由于体机虽已感染了HSV-2，但仍处于“窗口期”，因此血清学检测为阴性结果。为了早期反映机体的感染情况，实时定量PCR法更优于ELISA法。

    总的来说，本实验室建立HSV2实时定量PCR方法是较为成功的，与传统的ELISA法相比敏感性更高，更有利于HSV2感染的早期诊断。

【参考文献】
［1］Jonsson MK，Wahren B．Sexually Transmitted Herpes Simplex Viruses ［J］.Stand J Infect Dis，2004，36(2)：93101．
［2］Freij BJ．Management of Neonatal Herpes Simplex Virus Infection ［J］.Indian J Pediatr，2004，71(10)：921926．
［3］Kntyavin IV，Afonina IA，Mills，et al. 3′minor Groove BinderDNA Probes Increase Sequence Specificity at PCR Extension Temperatures［J］．Nucleic Acid Res，2000，28(2)：655661．