实用哺乳动物细胞培养手册（三）

细胞培养环境

1、实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受 其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响， 要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌 操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一 室。

2、常用设施及设备

（1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。

（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作 台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及 消毒好的无菌物品等。

（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物

（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。

（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。

3、培养器皿 常用细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。常准备量是使用量的三倍。器皿应选择透明度好、无毒、利于细胞粘附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品 或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面几种。

（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有 500 ml、250 ml、100 ml 等几种。

（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细 胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于

1 cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有 200 ml、100 ml、50 ml、25 ml、10 ml 等几种。

（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径 30 mm、60 mm、120 mm 等几种。

（4）吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有 球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。常用 1 ml 和 10 ml 两种。短吸管也叫滴 管，分弯头和直头两种。

（5）离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用 于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为 50 ml、

30 ml、15 ml；后者则多为 10 ml 和 5 ml。

（6）其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。

4、细胞培养温度

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为 36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过 39℃ 时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在 39-40℃1 小时，即能受到一定损伤，但仍有 可能恢复；在 40-41℃1 小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1 小 时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在 43℃ 以上 1 小时，细胞全部死亡。相反，温度不低于 0℃ 时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作 用；把细胞放入 25－35℃ 时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢；放在 4℃ 数小时后，再回到 37℃ 培养，细胞仍能继续生长。细胞代谢随温度降低而减慢。当温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰受损而死亡。但是，如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂（二甲亚砜或甘油），可在深低温下如－80℃ 或－196℃（液氮）长期保存。

5、合适的气体环境

气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧

气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。 开放培养时一般把细胞置于 95% 空气加 5% 二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基

的 pH 值。大多数细胞的适宜 pH 为 7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。 但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。但有一些细胞也喜欢偏 碱环境中生长，如成纤维细胞最适合 pH 是 7.4-7.6。每种细胞都有其最适 pH 值。