实验方法丨蛋白质体外瓜氨酸化

组蛋白的翻译后修饰过程对 DNA 转录，染色体功能以及维护细胞信号传导通路的正常运行具有重要的作用，瓜氨酸化是由称为蛋白质精氨酸脱亚胺酶（Protein Arginine Deiminases，PADs）的酶家族催化的许多关键组蛋白修饰手段之一。PADs 催化肽基精氨酸水解，在组蛋白上形成肽基瓜氨酸，调节与染色质结构相关的许多生化过程。

PAD 家族由钙依赖性同工酶 PAD1, 2, 3, 4 和 6 的五个成员组成。组蛋白瓜氨酸化是通过在组蛋白上转化精氨酸而影响染色体结构，导致氢键的减少和染色质解聚。很多重大研究已经将 PAD 确定为与癌症，自身免疫性疾病（类风湿性关节炎）和炎性疾病等许多人类疾病相关的药物发现项目的重要靶位。

实验材料

• PAD Cocktail, Active（#P312-37C ): 10µl Active  PAD Cocktail (包含 5 µg 总 PAD 蛋白）用 20ul PAD cocktail 稀释缓冲液进行稀释；

• 抗-GST 抗体交联的 Agarose Beads: 可购买商品化产品或实验室自制；

• PAD cocktail 稀释缓冲液：推荐配方为 0.1M tris-Cl, PH 7.4, 0.25 mM DTT, 10 mM CaCl2；

• PAD 缓冲液：推荐配方为 0.1M tris-Cl, PH 7.4, 5 mM DTT, 10 mM CaCl2, 10 µg/µl aprotonin,  10 µg/µl  leupeptin, 10 µg/µl pepstatin；

• 4×Laemelli 样品缓冲液：推荐配方为 8% SDS，40% Glycerol，250 mM tris-Cl, PH 6.8，0.02% Bromophenol Blue, 8% β-mercaptoethanol；

• 底物蛋白：根据各实验室的研究目的。

实验步骤

1. 用 PAD cocktail 稀释缓冲液清洗和平衡 5µl 抗-GST 抗体交联的 Agarose Beads；

2. 混合平衡后的 5µl 抗-GST 抗体交联的 Agarose Beads 和稀释好的共 30µl PAD Cocktail，在 4°C 孵育一个小时，并进行摇晃；

3. 阴性对照，仅含有 PAD cocktail 稀释缓冲液；

4. 孵育以后 Agarose Beads 用 PAD 缓冲液进行清洗；

5. 清洗以后加入 10µl 底物蛋白和 100µl PAD 缓冲液，在 37°C 孵育 2 个小时，并进行摇晃；

6. 离心，获取上清，上清中含有被瓜氨酸化的目的蛋白；

7. 用 25µl  4×Laemelli 样品缓冲液终止反应；并将样品纯存于-80°C 以备进一步深入研究。