家兔椎间盘细胞培养实验

家兔

培养液 DMEM Hanks’缓冲液 胎牛血清 胰岛素 转铁蛋白 亚硒酸盐 青霉素 链霉素

培养皿 培养瓶 烧瓶 试管 眼科剪、眼科镊 CO2 培养箱 pH 计 恒温水浴

一、实验步骤
 

1.  组织块贴块法

（1）取材：空气栓塞法处死家兔后，在无菌状态下获取家兔椎间盘组织。置于准备好的DMEM 培养基(含双抗)。迅速带回到无菌超净台上。

（2）剪切：在超净台上，进一步将周围组织分离，用Hanks'液冲洗数遍，直到冲洗液透明为止。眼 科剪刀将组织修剪为1~2 cm³ 大小的小组织块，Hanks'冲洗干净。加入少量含血清的培养液。(组织块不宜过小，否则不容易爬出足够数量的细胞)。

（3）接种：用吸管吸取小组织块入培养瓶底部，摆放均匀，一个25 cm² 的培养瓶可放置10-15 个小组织块，翻转培养瓶，加入少量培养液。4~6 小时后，待组织块充分贴壁后，再翻转回来(动作一定要轻巧， 以免刚刚贴壁的组织块脱离瓶底)。

（4）于5% CO₂ 孵箱中培养，每隔 3 天换液。待细胞 95%融合时，0.25%胰蛋白酶传代分瓶。

2.  酶消化法

（1）前面步骤同组织块贴块法 1、2。

（2）组织块再进一步剪切，此时培养液中最好不加血清。

（3）完毕后，加入消化液，移入到10  ml 离心管，培养箱内消化。

（4）每隔20 分钟，用吸管吹打一次，观察液体有否变浑浊，并取少量液体，在相差倒置显微镜下观察。

（5）0.4%台盼兰染色计算活细胞数目。

（6）接种密度在10⁵ 数量级。置于5%CO₂ 孵箱中培养，每隔 3 天换液。

（7）待细胞 95%融合时，0.25%胰蛋白酶传代分瓶。

二、结果

IVD 细胞为类软骨细胞，描述：单层细胞形状不规则，可呈三角形、多角形，梭形及不规则形。不同于成纤维细胞。如下图：

图1：组织块贴块法
 

图2：传代细胞形态
 

图3：细胞传代前状态95%融合

 椎间盘位于相邻两个椎体之间，取材过程较为繁琐， 要求动作迅速，争取在家兔死后半小时内完成，否则，该组织对缺氧耐受性差导致培养失败。