病原体的检测：标本的采集，在发病一周内取血液，第二周取尿，有脑膜刺激症状取脑脊液，其检出率较高。
(1) 直接镜检：将标本用差速离心集菌后作暗视野镜检或用Fontana镀银染色镜检，也可用直接免疫荧光法或免疫酶染色法检查。
(2) 分离培养与鉴定：将标本接种在Korthof培养基中，28℃培养2-4周，如有生长则培养基变混浊，再用暗视野显微镜检查钩体的存在，如有钩体再用血清学方法鉴定其群型。
(3) 动物接种：是分离钩体的敏感方法，尤其适用于有杂菌污染的标本。方法是将标本接种于幼龄和地鼠腹腔。接种3-5天后，用暗视野查腹腔液；可取心血检查并作分离培养。动物死后解剖，可见肺部和皮下有出血斑、肝、脾等脏器中有大量钩端螺旋体存在。
(4) 检测核酸方法：用同位素或生物素标记DNA探针进行核酸杂交及PCR方法均可检测标本中钩端螺旋体的核酸进行诊断，其特异性、敏感性均优于培养法，且得出的结果快速。此外限制性内切酶指纹图谱也可用于钩端螺旋体的菌株鉴定和分型。