寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA

实验概要

本实验介绍了寡聚(dT)-纤维素柱层析法纯化mRNA。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A )的特点，在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚(dT)纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。

实验原理

真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构(m⁷G)和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly(A)尾，通常用Poly(A )表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

主要试剂

1．3M醋酸钠(pH 5.2)
2．0.1M NaOH
3．1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA(pH 8.0)；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育(30min)的10%SLS至终浓度为0.1%。
4．洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS
5．无水乙醇、70%乙醇
6．DEPC

实验步骤

1．将0.5-1.0g寡聚(dT)-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。
2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚(dT)-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H₂O洗柱。
3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4．将RNA溶解于DEPC H₂O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。
5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。
6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD₂₆₀测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD₂₆₀值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD₂₆₀值很低或无吸收。
7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A )RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。
8．OD₂₆₀测定Poly(A )RNA分布，合并含Poly(A )RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。
9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A )RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。
10. 用适量的DEPC H₂O溶解RNA。

注意事项

1．整个实验过程必须防止Rnase的污染。
2．步骤(4)中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A )尾处的二级结构，使Poly(A )尾充分暴露，从而提高Poly(A )RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。
3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4．寡聚(dT)-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH₂O、上样缓冲液洗柱。
5．一般而言，10⁷哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A )RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。