通过乳胶珠沿微管的移动来观察基于微管的运动蛋白活性
通过微管滑行来观察基于微管的运动蛋白活性
| 实验材料 | 微管 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 聚赖氨酸溶液 |
| 仪器、耗材 | 盖玻片 |
| 实验步骤 | 1. 准备该显微检测所需的盖玻片： (1) 盖玻片在 200 μg/ml 聚赖氨酸溶液中室温过夜。 (2) 玻片在盛有 15 ml 蒸馏水的培养皿中翻转洗涤 4 次，每次 10 分钟。 (3) 洗过的盖玻片风干并存放在无灰尘的容器中直到使用。 2. 用含 1 mmol/L 的 PME 缓冲液 300 倍稀释羧基化了的乳胶珠，得到 2.5% 的悬浮液。 3. 在含 2 mmol/L ATP 的 PME 缓冲液中混合稀释了的珠子和含运动蛋白的微管相关蛋白溶液（或纯化的蛋白本身)。1 倍体积的珠子比 4 倍体积的蛋白溶液。在 4℃ 至少冷浴 5 分钟，使蛋白结合到珠子上。 4. 在小离心机上沉降珠子加以收集，用新鲜缓冲液重新悬浮。 5. 从冰箱拿出一份不含微管相关蛋白的用紫杉醇稳定的微管，可以是通过盐抽提紫杉醇稳定的微管或通过紫杉醇诱导组装磷酸纤维素纯化的微管蛋白二聚体而制备的。这些微管以 1:3 的比例（微管:珠子，体积:体积）加到包被/蛋白的珠子上。 6. 5 μl 珠子溶液和微管加到包被有聚赖氨酸的盖玻片上。翻转到一块显微镜载玻片上并用图像增强了的微分干涉相差显微镜观察。聚焦到在包被有聚赖氨酸的盖玻片上不动的微管，观察珠子结合微管并沿着微管转运。 |
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