小脑颗粒神经元的原代培养

实验方法原理 小脑颗粒神经元的体外培养受取材部位、特殊培养条件等因素的影响，易于获得纯度较高的培养物。该细胞为双极突起，常用来研究神经突起的生长。其培养条件具有高浓度钾离子依赖特性，常用来作为诱导神经元凋亡的研究模型。当成熟颗粒神经元的培养液由高KCl(通常是25-30mmol/L)换为低KC!(基本培养液中已含5mmol/L KCl)时，细胞会逐渐发生凋亡。

实验材料 新生7d的SD大鼠仔鼠

试剂、试剂盒 10%胎牛血清+DMEMNeurobasal+B27KCl

仪器、耗材 培养瓶

实验步骤

原代培养来自于新生7d的SD大鼠小脑颗粒神经元，可参考Moreno-Flores的方法，此方法培养的小脑颗粒神经元纯度达到95%以上。具体操作过程如下。

1.首先依照总论的方法获得细胞悬液，然后在离心获得的细胞沉淀中，加入少量的完全培养液(Neurobasal+B27+25mmol/L KCl)重悬细胞，再根据细胞计数的结果补加适最的完全培养液。根据培养目的按照合适的密度接种细胞于多聚赖氨酸包被的介质上，37℃,5%CO2的孵育箱内培养。

2.细胞培养第4天1/2量换液，至第7天细胞基本成熟。小脑颗粒神经元胞体小，接种后约24h,开始伸出突起，突起易成束生长。图I-2示接种48h后细胞生长情况。

注意事项

1.在原代取材时，由于取材部位和仔鼠体积的原因，通常将消过毒的仔鼠放置在100mm玻璃皿中，直接用解剖器械取出完整的小脑，不做断头处理。

2.小脑的脑膜不易剥离干净，要特别仔细去除，否则培养物中成纤维细胞的污染难以去除。

3.由于培养细胞的目的不同，接种时的密度就有区别。如用于神经突起观察，可接种(1-3)x105/cm2的密度；如用于凋亡诱导的研究，可接种(4-6)x105/cm2的密度。

4.在做凋亡诱导时，通常将含高钾的培养液全量换液为不含额外添加KCl的普通Neurobasal+B27培养液即可。按照核固缩判断的方法，8h后凋亡的细胞数量可达40%左右。

其他

1小脑颗粒神经元胞体小，突起细长，且容易成束生长，个人感觉该细胞可做突起生长的大致观察，并不适合利用软件分析突起长短。神经元一般3-4d突起就可长好，可开始观察。

2.在体外培养7d左右待细胞成熟后，可以开展凋亡实验。如添加保护剂抑制凋亡，应注意诱导凋亡的时间不可过长，否则可能导致保护实验失败。