小鼠原代小胶质细胞吞噬功能的分析

实验概要

本实验主要介绍从小鼠大脑分离的神经胶质细胞的吞噬功能。

实验步骤

为了检测小胶质细胞的吞噬功能，利用凋亡的神经祖细胞作为目标，因为在体外环境下它能最模拟自然条件下小胶质细胞的吞噬目标。

1. 将神经祖细胞（NPC）置于0.1M PBS 2mg/ml木瓜蛋白酶（Worthington）溶液中进行分离，37ºC作用30min。

2. 将分离的NPC 在紫外光下处理15-20min。

注：此步应该在一个很薄的塑料培养皿中进行，厚的塑料（如15或50毫升锥形管）将阻止很大部分紫外线光，导致细胞凋亡不理想。

3. 用含40mL PBS（RT）的50 mL锥形管中洗NPC，室温离心（1200 转/min，7min），缓慢减速，弃掉上清液。

4. 室温条件下在5 mL 0 .1 M PBS溶液中重悬NPC。

5. 向NPC中加入5mL sta 5（6）-TAMRA，SE（Invitrogen公司），立即涡旋， 37ºC避光孵育15min。

6. 用40 mL预冷的0.1M PBS洗3次（如步骤3）。

7. 将NPC悬浮在1 mL DMEM / F12（Invitrogen公司）培养液中双抗（Invitrogen公司），用血球计数板计数细胞。稀释或浓缩细胞数至5 ×10 ⁶每毫升。

8. 按10:1的比例，将NPC加至小胶质细胞（已经吸附于24孔板中盖玻片上），加入含10％胎牛血清（Atlanta生物）双抗的900mL DMEM / F12培养基。

9. 置于37℃和5％CO₂培养箱中培养。

10. 在所需的时间点（如1h，2h和5h）从培养箱中拿出。

11. 在无菌环境中，用钳子拿出盖玻片，在温热的PBS中轻柔的浸洗20次（除去未吞噬的NPC）。将盖玻片置于含1mL4％PFA的24孔板中，再次放置盖玻片于培养箱中等待下个所需的时间点。

12. 将细胞固定于盖玻片上，避光20min，用0.1M PBS洗3次。

13. 用含10％血清、0.3％的Triton X-100和0.5％BSA的PBS溶液，避光作用1小时封闭盖玻片。

14. 滴加CD11b的抗体（1:100）（eBioscience），避光，常温孵育1h。

15. 用0.1M PBS洗盖玻片3次PBS。

16. 滴加二抗（1:1000，Invitrogen公司），室温下孵育1h。

17. 用0.1M PBS洗盖玻片1次PBS。

18. 滴加DAPI（1:20,000）孵育5min。

19. 用0.1M PBS洗盖玻片3次PBS。

20. 用Aqua-Mount封片剂封片。

21. 通常情况下， “吞噬指数”可以根据CD11b的小胶质细胞总面积除以NPC标记的总面积来计算。

22. 在共聚焦显微镜下用Z- stacks拍照检验NPC吞噬实验的有效性。