小鼠多能ES细胞的增殖实验

PBS 胰酶溶液

MEF 滋养板 巴斯德吸管 ES 生长培养基

1. 准备下列试剂和材料：

60 mm MEF 滋养板（接种不能超过 7 天）

带棉塞无菌巴斯德吸管

无 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ PBS

ES 生长培养基

胰酶溶液

2. PBS 冲洗 ES 细胞，巴斯德吸管加胰酶溶液覆盖培养皿底（2 ml/p60）

3. 37℃ 孵育 5 分钟左右，至细胞脱落。

4. 巴斯德吸管轻轻吹吸胰酶处理细胞 4~6 次，分散 ES 细胞。分散的细胞，包括单细胞和小的细胞团，转移至装有 2 ml 预热（37℃）ES 生长培养基的 15 ml 离心管。

5. 离心收集细胞。吸掉上清，留约两倍于细胞沉淀的体积。轻弹离心管悬浮细胞。加 10 ml ES 生长培养基，吹吸至悬液均匀。

6. 计数细胞。由于 ES 细胞较 MEF 细胞小，呈圆形，二者很容易区分。

7. ES 细胞接种 60 mm MEF 滋养板。吸掉 MEF 滋养细胞培养基，加入悬于 5 ml ES 生长培养基的 ES 细胞。

8. 每天换一次液，加 5 ml ES 生长培养基。