小鼠精原干细胞分离培养

实验概要

小鼠精原干细胞分离培养

主要试剂

0.1%明胶、DPBS、0.25%胰蛋白酶、400目细胞筛、精原干细胞培养液、1 mg/mL胶原酶Ⅳ、7 mg/mLDNase、细胞基础培养液、DMEM-C、精原干细胞冻存液(Kubota et. al., 2004a and 2004b)（4℃条件下可以保存1个月）

主要设备

3.5 cm培养皿、400目细胞筛、12孔板、6孔板、冻存管、15 mL离心管、外科手术刀、外科手术剪、医用镊、二氧化碳培养箱、微量移液器、细胞计数仪、超纯水系统、超低温冰箱、实体解剖镜

实验材料

2～4只出生5～10天的小鼠。

实验步骤

（1）分离小鼠睾丸细胞
①向一个3.5 cm培养皿中加入1～2 mL预冷的DPBS。
②脱臼法处死小鼠，用外科手术器械打开腹腔，取出双侧睾丸，置于培养皿中，去除白膜，将睾丸用DPBS洗2～3遍。
③小心去除DPBS，向培养皿中加入1～2 mL 1mg/mL胶原酶Ⅳ，放置于37℃培养箱中孵育10～15 min。取出后用1 mL移液器小心吹打，将睾丸间质细胞吹散。
④将胶原酶Ⅳ小心去除，然后用DPBS轻轻洗两遍，去除D-PBS，加入0.8 mL0.25%胰蛋白酶和0.2 mL 7mg/mLDNase，37℃培养箱中孵育10 min。取出后用1 mL移液器充分吹打至细胞完全分散。
⑤加入5 mL细胞基础培养液终止胰蛋白酶反应。
⑥将上一步的细胞悬液用400目细胞筛过滤到离心管。
⑦室温1500 r/min离心5 min，弃上清，用精原干细胞培养液重悬细胞，并计数。
（2）铺板和差异贴壁筛选
①用0.1%明胶包被1块12孔板，放置于室温或者37℃、5%CO₂培养箱30 min以上。
①将细胞悬液转移到0.1%明胶包被过的12孔板中，细胞密度为2×10⁵～4×10⁵细胞/孔，每孔1 mL培养液。
②放入37℃、5%CO₂培养箱中培养过夜。
③1 mL移液器反复吹打10～15次后将悬浮的细胞转移到另一12孔板中(Ryuet. al., 2005)。此时只有很少量的生殖细胞和大部分贴壁生长的体细胞残留在明胶铺被的12孔板上，而第二块板上生殖细胞相对富集(Oatleyet. al., 2006)。
（3）培养及传代
①隔天半量更换新鲜的精原干细胞培养液。
②一周内，转移到第二块12孔板的细胞增殖并铺满孔底。第一次传代的时间取决于克隆生长的状况，推荐传代时间为开始培养后10～14天。
③吸尽培养液，用DPBS轻轻洗两遍，每孔加入200 μl0.25%胰蛋白酶，37℃培养箱内孵育4 min，然后每孔加入1 mL细胞基础培养液终止胰蛋白酶反应。收集细胞悬液至15 mL离心管，室温1500 r/min离心5 min。弃上清后用精原干细胞培养液重悬细胞，按照1:1的比例重新铺板。克隆长到原来的大小大约需要10天，这时候将细胞再传一代（传代比例1:2）。
（4）维持生长
①从第三代开始，将细胞接种到丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上。从分离开始30天左右细胞可以稳定传代。
②细胞稳定后，传代时细胞密度为3×10⁵细胞/六孔板的一个孔，每三天半量更换新鲜的精原干细胞培养液。
③根据细胞增殖情况，每4～6天传代。
（5）冻存与复苏
精原干细胞冻存复苏的方法与其他细胞相似(Avarbocket. al.,1996)。

1. 冻存
   1.将离心后的细胞用精原干细胞冻存液重悬，密度为16×10⁶～20×10⁶细胞/mL。
   2.1个冻存管分装1 mL细胞悬液。
   3.用分步法或程序降温盒冻存细胞，液氮中可长期保存。
   

2. 复苏
   

1. 提前一天准备铺有饲养层细胞的培养皿。
   

2. 准备一个15 mL离心管，装有3 mL DMEM-C备用。
   

3. 将冻存管置于37℃水浴锅，使细胞悬液迅速融化，然后将细胞悬液加入第①步的离心管中。
   

4. 室温1500 r/min离心5 min，去除上清，加入精原干细胞培养液重悬后接种到铺有饲养层细胞的培养皿上。