小鼠胚胎干细胞培养实验步骤（一）

一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态
培养基
细胞复苏
冻存细胞
明胶包被
细胞传代

体外分化
培养基
包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）
体外分化方法

注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。

一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

培养基
ES:
配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。

贮存液          
DMEM(高糖)          
马血清（HS）          
L-谷氨酰胺（200mM）          
MEM NEAA（10mM）          
HEPES（1M）          
β-巯基乙醇（55Mm）          
PEST          
LIF         

复苏细胞
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤：
1．从液氮中取出一管细胞；
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
5．离心3分钟；
6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
8．孵育。

冻存细胞
冻存液
90％HS和10％DMSO

步骤：
1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
2．用细胞刮刀收集细胞；
3．将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟；
4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10 cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）
5．分装于冻存管内，每管1ml；
6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。