小鼠胚胎干细胞培养实验步骤（三）

ITSFn and N3（分化培养基）：
配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml 离心管中，（稀释为1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。
贮存液          
DMEM(高糖)          
转铁蛋白50mg/ml          
胰岛素5mg/ml          
亚硒酸钠300μM          
黄体酮（20μM）          
腐胺（100μM）          
PEST（P104U/ml S104μg/ml）          
层粘连蛋白100μg/ml          
纤维连接蛋白250μg/ml           
碱性rhFGF, 10μg/ml          
*在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。

ITSFn and N3培养基贮存液的准备
使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。
贮存液  溶剂，贮存液，稀释剂和储存
转铁蛋白50mg/ml  
胰岛素5mg/ml  
亚硒酸钠300μM  
黄体酮（20μM）  
腐胺（100μM）  
PEST（P104U/ml S104μg/ml）  
层粘连蛋白（100μg/ml）  
纤维连接蛋白（250μg/ml ）  
碱性rhFGF, （10μg/ml）  

包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

包被液的准备
多聚-L-赖氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-赖氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。
纤维结合蛋白，1μg/ml
把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。

包被过程：
1．加入多聚-L-赖氨酸，至少2－3小时（过夜也行）
2．吸出多聚-L-赖氨酸
3．加入纤维结合蛋白，大约1－2小时
4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干
5．贮存在4℃
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。

体外分化方法

第1步：ES培养基
在LIF存在的条件下维持细胞培养

第2步：EB培养基
使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）
2．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。
3．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液
4．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5．2天后更换培养基
将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。