小鼠角质细胞的分离和培养

实验试剂

HBSS： 
NaCl 8g/L
KCl 400mg/L
KH₂PO₄ 60mg/L
无水Na₂PO₄ 47.86mg/L
无水葡萄糖 1000mg/L
NaHCO₃ 350mg/L

实验材料

妊娠期BALB/c小鼠

实验步骤

1. 将1~2天龄新生裸鼠窒息后，置于培养皿中，用1%碘聚乙烯吡咯烷酮液洗净裸鼠，流水彻底冲洗，然后用70%乙醇洗两次。小鼠应立即使用，若待处理的小鼠数量较多，可置冰上30min。
2. 去除小鼠的四肢和尾巴。
3. 将小鼠从尾巴至鼻子的皮肤作一简单切口，用大鼠牙齿镊轻轻将整个身体的皮肤剥下，用一把镊子夹住身体，另一把镊子拉开皮肤。
4. 将剥下的皮肤组织置于放在冰上的无菌培养皿表面，直至所有的皮肤收集完毕。
5. 用2把大鼠牙齿钳夹住皮肤组织，在含2.5%胰蛋白酶的HBSS无菌培养皿中漂洗皮肤组织（组织在下），然后置4^oC过。表皮不应淹没在胰蛋白酶液中。
6. 从胰蛋白酶处理液中取出组织，将表皮面朝下置于干燥的无菌细胞培养皿表面。表皮易于贴附于塑料上，组织用组织钳扯去，鼠龄与此有影响，天龄越大，去其表皮越困难。
7. 用剪刀小心地将表皮残留物剪碎，置于含“常规"培养液（MEM含10%FCS，100IU/ml青霉素，100ug/ml链霉素，2~4mmol/L L-谷氨酰胺；每5只小鼠皮肤用10ml）的无菌烧瓶中，磁力搅拌器37^oC剧烈搅拌45min。
8. 用4层无菌Nitex纱布（16um孔，Martin提供）过滤液体。当其他细胞通过时角质层细胞留在纱布的表面。
9. 用培养瓶将细胞洗下，培养基的用量约为一块皮肤10ml，将细胞接种于塑料细胞培养瓶中或玻璃盖玻片上，37^oC培养4~12h。
10. 4~12h后观察培养皿表面的细胞群。
11. 将细胞转移至低钙培养液，角质细胞将开始繁殖。这种转移防止细胞的分层。低钙液由MEM（无钙）和10%螯合的FCS（同样含有正常水平的青霉素、链霉素）组成。螯合的血清按下法准备：每50ml血清需20g树脂，Chelex 100（Bio-Rad）。将树脂置于水中，40g/L，pH约为7.4，放置滤纸于漏斗上，过滤树脂。加入树脂于FCS中，搅拌60min。接着过滤使血清变得清亮，再用0.45ug滤纸除菌。后者过滤过程较慢。需用购买的商品化滤器。完全培养液中钙离子浓度约为0.09mmol/L，与0.15mmol/L钙浓度相比这是普通培养液。

注意事项

小鼠角质细胞在低钙中维持至1周时间，尽管细胞活力有所降低。可通过商业途径如Clonetics和GIBCO/BRL获得书中低钙、无血清培养液培养角质细胞。胶质细胞在这种培养液中能保存较长时间，并在多数情况下进行几次分裂。为了诱导角质细胞分层，应向细胞中加入正常水平的钙。
使用一次性塑料组织培养器材，而不是玻璃器材。若确需使用玻璃器材，应用酸浸泡后再行高压灭菌。需要使用的器材还有大叔牙齿钳、尖解剖剪、活组织吸取器。上述器材应高压灭菌或在95%乙醇中浸泡、烧灼。