岛津原子力显微镜在生物学及生命科学中的应用

在生物学及生命科学研究中，各种显微镜是必不可少的工具。列文虎克发明的简单显微镜推开了人类对微生物观察的大门，显微学的发展随着显微工具的进步而深入。光学显微镜利用激光共聚焦技术将分辨率逼近了可见光波长的一半，电子显微镜进一步将其提高到纳米级别。但是对于生物学和生命科学而言，二者都无法完全满足应用需求。对于细胞微观结构和生物大分子，光学显微镜的分辨率不足；而电子显微镜虽然有效提高了观察能力，但严格要求真空环境，无法在细胞及生物大分子的活性状态（液体环境）中使用。

原子力显微镜的问世，成功解决了在高分辨率与液体环境观测之间难以兼得的难题。作为一种三维形貌观察工具，原子力显微镜不仅具备超高分辨率，而且支持在液体环境下工作，是一种理想的生命科学/医学观测设备。除了形貌观察外，原子力显微镜还可以对多种表面属性进行定量观测。例如，基于力学测试的表面机械性能测试。这些性能为原子力显微镜应用于细胞和生物分子研究提供了技术基础。

1细胞学研究

利用原子力显微镜进行活细胞观察，得到的是贴壁细胞的真实形貌。相对于光学显微镜仅能得到投影面积，原子力显微镜可获得细胞表面积和体积数值，这两个数值更能反应细胞的生长发育阶段，有利于判断其活性状态。

2007年发明的诱导式多能性干细胞(iPS)技术有效排除了实验的伦理风险，是非常有潜力的干细胞技术。iPS转化过程中，会有一定的几率发展为癌细胞。不同体细胞来源的iPS细胞成瘤性有差异。可以使用原子力显微镜对未分化的iPS细胞和HeLa细胞进行观察比较，有效分析细胞状态。HeLa细胞是一种被广泛使用的癌变细胞，因此可以和iPS细胞进行对比观察。

上图显示了SPM形状图像(a)HeLa细胞和(b)iPS细胞。用光学显微镜观察到的相应相位差图像分别显示在(c)和(d)中。图中箭头所示位置处的截面形状轮廓如(e)和(f)所示。

从细胞形态上来看，HeLa细胞呈圆顶形，表面隆起比较高，约7um；而iPS细胞呈扁平状且细胞间粘附呈网状结构，细胞高约1.7um。仔细观察细胞之间的边界，可以看出HeLa细胞之间的边界呈凹陷状，而iPS细胞之间的边界是凸起的，而且呈网络状。据此可分析得知这两种细胞各自的间粘附具有差异，且HeLa细胞之间的粘附较弱，而iPS细胞之间的粘附较强。

除了形貌观察外，原子力显微镜还可以通过力学测量获得细胞表面的机械性能。使用弹簧常数为0.15N/m的OMCL-TR800PSA探针，在培养液环境中对活细胞进行测试。对细胞的最终压力(排斥力)为2.5nN。通过比较从探针与样品接触的位置到达到2.5nN的力的变化，确定样品的硬度。

(a)和(b)显示了SPM观察到的HeLa和iPS细胞的细胞形状图像，(c)和(d)显示了相应的ZX断面图像，是从样品竖截面方向看时在(a)和(b)中箭头所示的X线位置处施加到探针的力的图像。图中上方为测量起点，下方白色虚线为压触终点，显示了样品截面形状轮廓。

在ZX图像中，探针与样品接触后检测到力的位置以黄色到红色的颜色显示。因为这表明探针对细胞的变形，所以可以理解较大量的细胞变形显示细胞的较软部分。可以从细胞变形量了解硬度。(c)中的HeLa细胞显示出均匀的变形，但相比之下，在(d)中的iPS细胞中，细胞体较软，细胞间粘附区较硬。

分析结果表明，HeLa细胞表面硬度比较均匀，软硬部分差别不大，而iPS细胞主体较软，细胞间粘附区较硬。

2生物大分子的高分辨观察

生物大分子一般尺度在几个纳米到几十个纳米之间，原子力显微镜在这个范围的纳米分辨能力也是非常适合的。例如DNA是经常会被观测的一种样品，使用基于调幅的轻敲/动态模式，一般只能看清链状结构。

液体环境下轻敲模式扫描DNA链

这种模式受悬臂梁振动质量因子（Q值）的影响非常大，在液体环境中，因为液体对悬臂梁的粘滞阻力，导致Q值急剧降低，从而使分辨率变差。而调频模式受此影响较小，可以对缓冲溶液或者培养液环境下的生物大分子进行超高分辨的观测，获得接触模式或者轻敲模式无法达到的超高分辨率。

同样是观察DNA双螺旋链，使用调频模式，可以清晰地分辨双螺旋结构，双螺旋结构形成的大沟小沟结构也非常明显。

更细致地观察一个螺距，还可以分辨表面的碱基数目。

对相邻两个螺旋的剖面图进行分析，观察到的碱基数量与理论值完全符合。这说明调频模式在液体环境中，对柔软的生物样品观察，依然可以达到基团级别的分辨率。

3生物医药应用

生命科学的快速发展直接推动了生物医药领域的进步，诸多科研成果转化为治疗疾病的有效手段。

外泌体和微泡是医学和免疫学的前沿研究热点。然而，对于它们的三维形态和膜的物理性质还有许多方面的认识尚不清楚。外泌体因为其单层膜的性质，所以非常软，对使用原子力显微镜测试提出了极高的要求。

以上两幅图就是在生理盐水环境中不同尺寸的外泌体，其外径从20nm到140nm不等，表面极其柔软，杨氏模量一般只有几千Pa。

脂质体包裹药物是药物输运系统（DDS）的一个重要分支。利用不同的包裹分子，可以实现药物的定点投送，有利于提高受体结合特异性和减少用药浓度。

利用原子力显微镜可以在液体环境中对包裹体小球形态进行观察。

此外，作为精密的力检测工具，还可以利用原子力显微镜对包裹体颗粒与液体的固液界面进行观测，获得界面处力梯度分布。这项研究有利于分析不同的包裹分子在液体环境中的自体维持能力和特异位点亲和能力，因此是一种很有效的分析工具。

作为可以兼顾高分辨率和液体环境的微纳米分析工具，原子力显微镜具备天然的生物学和生命科学适用性。随着其技术的不断迭代发展，已经深入地渗透到了生命科学/医学的研究与实验中。尤其是如生物医学工程、仿生学等一些交叉学科的高速发展，相信原子力显微镜在此领域必有更深入的应用。

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