岛津原子力显微镜在细胞及分子生物学的研究进展

原子力显微镜作为一种三维形貌观察工具，不仅具备超高分辨率，而且支持在液体环境下工作，是一种理想的生命科学/医学观测设备。除了形貌观察外，原子力显微镜还可以对多种表面属性进行定量观测。例如，基于力学测试的表面机械性能测试。这些性能为原子力显微镜应用于细胞和生物分子研究提供了技术基础。

01 iPS干细胞研究

干细胞的研究一直受制于供体细胞很难获得，而且相关实验的伦理风险也不容忽视。因此2007年发明的诱导式多能干细胞(iPS)技术成为理想的胚胎干细胞替代技术。iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。但是iPS转化过程中，会有一定的几率发展为癌细胞。不同体细胞来源的iPS细胞成瘤性有差异。因此，如何筛选安全型iPS细胞是该技术能够进入临床实验的关键。

可以使用原子力显微镜对未分化的iPS细胞和HeLa细胞进行观察比较。HeLa细胞是一种被广泛使用的癌变细胞，因此可以和iPS细胞进行对比观察。

上图显示了SPM形状图像(a)HeLa细胞和(b)iPS细胞。用光学显微镜观察到的相应相位差图像分别显示在(c)和(d)中。图中箭头所示位置处的截面形状轮廓如(e)和(f)所示。

从细胞形态上来看，HeLa细胞呈圆顶形，表面隆起比较高，约7um；而iPS细胞呈扁平状且细胞间粘附呈网状结构，细胞高约1.7um。仔细观察细胞之间的边界，可以看出HeLa细胞之间的边界呈凹陷状，而iPS细胞之间的边界是凸起的，而且呈网络状。据此可分析得知这两种细胞各自的细胞间粘附具有差异，且HeLa细胞之间的粘附较弱，而iPS细胞之间的粘附较强。

除了形貌观察外，原子力显微镜还可以通过力学测量获得细胞表面的机械性能。如下图所示，用探针针尖压触细胞表面，通过对探针获得的力反馈分析样品各类机械性能。

使用弹簧常数为0.15N/m的OMCL-TR800PSA探针，在培养液环境中对活细胞进行测试。对细胞的最终压力(排斥力)为2.5nN。通过比较从探针与样品接触的位置到达到2.5nN的力的变化，确定样品的硬度。

(a)和(b)显示了SPM观察到的HeLa和iPS细胞的细胞形状图像，(c)和(d)显示了相应的ZX断面图像，是从样品竖截面方向看时在(a)和(b)中箭头所示的X线位置处施加到探针的力的图像。图中上方为测量起点，下方白色虚线为压触终点，显示了样品截面形状轮廓。

在ZX图像中，探针与样品接触后检测到力的位置以黄色到红色的颜色显示。这表明探针对细胞的变形，所以可以理解为较大量的细胞变形显示出细胞的较软部分。可以从细胞变形量了解硬度。(c)中的HeLa细胞显示出均匀的变形，但相比之下，在(d)中的iPS细胞中，细胞体较软，细胞间粘附区较硬。

分析结果表明，HeLa细胞表面硬度比较均匀，软硬部分差别不大，而iPS细胞主体较软，细胞间粘附区较硬。

02 DNA双螺旋的高分辨观察

DNA是经常会被观测的一种样品，使用基于调幅的轻敲/动态模式，一般只能看清链状结构。

液体环境下轻敲模式扫描DNA链

提高液体环境中的分辨率的办法就是使用调频模式替代调幅模式（轻敲/动态模式），完美应对了生物样品的测试需求。

传统的调幅模式检测在自由振动和受迫振动下同一频率处的振幅变化。这种模式受悬臂梁振动质量因子（Q值）的影响非常大，在液体环境中，因为液体对悬臂梁的粘滞阻力，导致Q值急剧降低，从而使分辨率变差。而调频模式是检测在自由振动和受迫振动下维持振幅不变时频率的偏移，在此模式下，分辨率受Q值的影响较小，因此在液体中依然可以保持原子/分子级别的高分辨率。而使用调频模式，可以对缓冲溶液或者培养液环境下的生物大分子进行超高分辨的观测，获得接触模式或者轻敲模式无法达到的超高分辨率。

同样是观察DNA双螺旋链，使用调频模式，可以清晰地分辨双螺旋结构，双螺旋结构形成的大沟小沟结构也非常明显。

更细致地观察一个螺距，还可以分辨表面的碱基数目。

对相邻两个螺旋的剖面图进行分析，观察到的碱基数量与理论值完全符合。这说明调频模式在液体环境中，对柔软的生物样品观察，依然可以达到基团级别的分辨率。

03 外泌体观察

外泌体和微泡是医学和免疫学的前沿研究热点。然而，对于它们的三维形态和膜的物理性质还有许多方面的认识尚不清楚。外泌体因为其单层膜的性质，所以非常软，对使用原子力显微镜测试提出了极高的要求。

我们用原子力显微镜观察了盐溶液中的两类外泌体并对其膜进行了表征。

以上两幅图就是不同尺寸的外泌体，其外径从20nm到140nm不等，表面极其柔软，杨氏模量一般只有几千Pa。

原子力显微镜作为一种传统意义上的材料学表面分析工具，随着其技术的不断迭代发展，已经深入地渗透到了生命科学/医学的研究与实验中。尤其是如生物医学工程、仿生学等一些交叉学科，新材料新方法的引入已经极大促进了这些领域从理论到实际应用的延伸。

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