工业生物技术VS生物制药：基于细胞工厂下的多元发展

工业生物技术和生物制药生产利用生物学使细胞系统成为工厂，生产对人类有价值的分子。这些生物技术过程利用各种宿主生物，并涉及生物燃料、聚合物构件、抗生素和全细胞疗法等应用。除了化学生产外，工业生物技术还可以实现环境和可持续发展目标。同样，生物制药领域已经并将继续生产救命药物。尽管这些应用多种多样，但这些领域依赖于共同的生物学主题，并且需要类似的遗传和代谢工程方法。通过合成生物学、靶向基因工程、DNA 测序、驯化和高通量筛选方面的进步，工业生物技术和生物制药生产利用相同的框架实现高效的生化生产，可在当前和未来的合作中利用该框架实现快速创新。

简介

重组 DNA 技术的强大功能使社会能够将生物技术应用于各种领域，而人类仍处于实现这些益处的早期阶段。即使在早期阶段，不同类型的细胞也已表现出解决特定类型问题的能力。例如，微生物的环境、基因、代谢和生长方式各异，在解决受益于多样化生物化学和强劲生长能力的应用方面特别有用。工程哺乳动物细胞具有非常复杂的能力，可以合成复杂的产品——从单克隆抗体 (mAb) 和疫苗到基因治疗载体。此外，哺乳动物细胞可以产生复杂且类似于人类的翻译后修饰，例如糖基化，这对于适当的药理活性至关重要。除了充当生物工厂外，用于生物制药应用的细胞已经超越了工厂的作用，本身也是药物产品，例如 CAR-T 免疫疗法。

工业生物技术利用生物技术生产大宗商品和特种化学品，或回收废物和塑料，其利用多种微生物作为细胞工厂。这些应用通常（但并非总是）以高产量、低利润产品为特征。工业生物技术最常使用细菌、酵母或真菌，利用中心碳代谢途径来实现和增强所需化合物的生产，应用领域包括生物燃料、大宗化学品和聚合物前体。除了化学生产外，这些生物的使用还扩展了可以利用的碳原料，包括木质纤维素生物质和废油。这些微生物可以帮助实现温室气体排放和废物管理的目标，同时可能进行生物化学生产。从自然界中分离或在研究实验室内设计的微生物可以耐受高温、高压、高盐和有毒化学物质等环境，有时甚至在这些环境中繁衍生息，而这些环境对商业生产是有利的。

与工业生物技术一样，生物制药生产依靠细胞系统来生产药物。然而，这些过程通常以低产量、高利润产品为特征。由此产生的化合物范围从小蛋白质和抗体到疫苗，甚至是作为递送工具或疗法的整个细胞。对于这些生物药物，需要进行广泛的临床研究和监管批准，以保护患者的治疗效果。所需产品的复杂性决定了宿主的选择，细菌和酵母中产生的产品更简单，而哺乳动物细胞系中产生的蛋白质更复杂，尤其是需要糖基化的蛋白质。适当的糖基化是药物产品的关键属性，会影响药物靶向、体内活性和半衰期。由于获批的单克隆抗体药物数量不断增长，中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞是最常见的宿主，骨髓瘤 NS0 和 Sp2、BHK- 21和人胚肾 (HEK293) 细胞也用于特定产品类别。

除单克隆抗体外，疫苗和细胞/基因疗法分别是最成熟和最新的生物制药产品。疫苗生产根据分类和复杂程度使用各种宿主细胞，而细胞和基因疗法通常仅用于特定细胞类型。与细菌和酵母相比，哺乳动物细胞的生长速度较慢，因此使用哺乳动物细胞会延长实验设计时间，这可能会给合成生物学工具的应用带来挑战。尽管如此，生物制药生产领域已能够生产多种药品。

在工业生物技术和生物制药生产中，后期生产工艺是从生物反应器环境的细胞和上清液的中分离所需产品的关键步骤。这些过程可能因所生产生物化学品的特性和应用而有很大差异，这需要额外考虑工艺放大和最终的经济可行性。用于下游工艺的单元操作可以包括过滤、层析、病毒灭活、液-液萃取和/或蒸馏，需要几个纯化步骤才能达到所需的纯度。无论是在工业生物技术还是生物制药生产中，下游纯化都是一个完全独立但相关的领域。

工业生物技术和生物制药生产代表了生物技术中的应用，它们依赖于生物学基础并使用相同的技术和方法（图 1）。每个领域在生产有用的生物分子方面都有独特的特点，如表 1所示。具体而言，工具和筛选方法的相似性将工业生物技术和生物制药生产结合在一起。

图 1. 合成生物学工具箱和菌株/克隆开发的进步使细胞系统可用作工业生物技术和生物制药生产中跨产品的生物工厂。这两个领域之间的进一步合作和创新可以利用相似性来实现生化生产的宏伟目标。

表 1. 工业生物技术和生物制药生产在生产有用生物分子方面的特点

合成生物学工具箱使基因工程更接近理想的“即插即用”系统，其中各个部件可以互换使用，并在宿主生物体中发挥可预测的功能。此外，包括 CRISPR 和测序技术在内的基因工程技术在过去 20 年中得到了显著改进，从而实现了更高效的细胞操作。借助这些新的基因改造技术，需要快速筛选来完成设计、构建、测试、学习周期，以提高生物分子的生产。除了分析开发之外，机器人和自动化还使这种快速筛选能够更快地识别出产量最高的菌株或克隆。

在信息较少的情况下，尤其是在非传统宿主中，人们利用驯化来提高化学产量或耐受恶劣环境。这些技术共同推动了两个行业的成功，并成为创新的共同基础。此外，这些行业依赖于相同的经济可行性和高效代谢基础，这增加了使用生物生产系统的复杂性。平衡培养污染风险与高效稳定生产，用于化学或药物的生物分子需要对生物系统有复杂的理解和控制。

为了成功开发未来的药物和生物化学品，持续和额外的合作努力可以促进创新，以应对 21 世纪与食品、燃料和人类健康有关的全球挑战。工业生物技术能够将非食用碳用于生物燃料工艺，并可以创造许多替代对不可再生化石燃料的依赖所需的商品化学品。虽然生物制药生产的应用范围更加广泛，但这些应用仍然涵盖各种医疗治疗，例如救命的胰岛素蛋白、高特异性单克隆抗体，甚至可以作为癌症和遗传疾病的治疗方法。本文将简要总结了工业生物技术和生物制药生产中与细胞系/菌株开发和工程相关的几个领域，为这些领域之间持续和额外的合作与创新提供动力。

生物制药生产与工业生物技术的相似之处

工业生物技术和生物制药生产严重依赖细胞系统作为“生物工厂”，生产具有多种用途的有用化合物。无论选择哪种生物和分子，工业相关规模的生产都依赖于利用 DNA 或 RNA 水平的生物操作来进行基因改造。这些系统还依赖于控制碳从原料到所需产品的相同代谢途径。

合成生物学的进展

合成生物学工具的发展使得各种生物体可用于生物生产。从基因表达的构建模块（零件工具箱）到基因编辑和 DNA 测序，合成生物学的进步促进了生物制药生产和工业生物技术应用的产品开发。

合成生物学工具包

重组化学和生物制品生产的核心是生物体的基因工程，以实现或增强生产。这种工程依赖于合成生物学部件（启动子、终止子、增强子等）工具箱作为构建模块，以实现高效的基因和蛋白质表达，并最终实现正确的蛋白质折叠和定位。这些工具箱组件还希望能够独立发挥作用，以便直接“现成”地混合搭配部件。由于这些构建模块在生物技术应用中发挥着关键作用，因此已经进行了大量研究来识别天然序列以及通过将较小的功能单元组合在一起来创建合成版本。就启动子而言，转录因子结合位点和有效的核糖体结合位点已成为从大肠杆菌和酵母到 CHO 细胞和人类细胞系的所有进化尺度上启动子设计的基础。作为继目标基因之后的第二重要核心元素，终止子通常通过序列修饰来实现表达的微调，以实现最佳表达。

启动子可能是合成生物学工具箱中研究最深入的组成部分。这些系统的工程设计会导致基因表达发生巨大变化。诱导和调节基因表达的能力对于在生长和蛋白质或化学品生产之间找到平衡至关重要。因此，在工业生物技术和生物制药生产应用中，需要在各种宿主生物中发现和开发启动子（表2）。启动子的长度和结构复杂性随着进化复杂性的增加而增加，细菌、酵母和哺乳动物生产宿主有几个关键特征（表2 ）。天然启动子序列的挖掘已应用于微生物和哺乳动物培养物，以利用先天转录因子结合基序。这些因子的保守存在使管线方法能够应用于任何感兴趣的生物体，以用于任何应用。

表 2. 合成生物学工具箱中可用于跨生产宿主基因工程的选定启动子的特征

具体而言，在哺乳动物细胞中，转录因子核因子 κB (NF- kappaB) 存在于生物制药应用中常用的 CMV 启动子中。虽然酵母中不存在这种因子，但逆行反应基因可以完成类似的功能。除了保守的结合基序外，所有生产宿主都需要并希望具有诱导性和多表达盒等特征，以进行生化生产。在许多情况下，核心启动子序列可以与其它启动子序列的上游激活序列多重化以生成新序列。持续研究和开发启动子序列（尤其是哺乳动物细胞的启动子序列）对于扩展合成生物学工具箱、以使用更短的序列实现更严格的表达控制并最终提高产量至关重要。

从各种基序构建的类似方法已应用于终止子的开发。尽管这些区域研究较少，但它们对于微调 mRNA 半衰期、以实现最佳基因表达至关重要，并且已在所有生产宿主中进行改造。在部署相同的序列结构时，酿酒酵母和人类细胞系中同时开发了一系列终止子，表现出广泛的活性。这些例子突出了合成生物学部分的 DNA 分子基础，这些部分在工业生物技术和生物制药生产的应用中是保守的。

虽然启动子和终止子被认为是控制基因表达的关键，但它们仅代表合成生物学工具箱的两个部分。为简洁起见，本文不讨论阻遏物、绝缘子、激活子和增强子，这些内容已在其它地方进行了广泛综述。随着各种合成生物学工具的不断发展，开源项目一直在寻求提供数据存储、工具组织和常规分析参考软件的标准化。这些努力包括合成生物学开放语言 (SBOL)、SynBioHub、SynBiopython，它们为实验室提供了工具和信息，以加快进展，因为可访问性使研究人员能够在他人工作的基础上进行研究。继续共享合成生物学工具箱知识将有利于工业生物技术和生物制药生产应用。

基因编辑，包括 CRISPR

用于工业生物技术或生物制药生产应用的基因工程依赖于将所需的基因有效运送到基因组内的已知位置。位点特异性工具（包括锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 和 CRISPR）的发现使这种精确的基因工程成为可能。通过利用 DNA 相互作用，这些方法可广泛应用于所有生命领域，并应用于工业生物技术和生物制药生产。CRISPR 的具体应用涵盖大量文献，大肠杆菌、酿酒酵母和 CHO 细胞的基因编辑在其它地方得到了广泛的评论。

除了直接基因编辑外，CRISPR/Cas 系统还被以多种方式修改和重新利用，成为一把“分子瑞士军刀”。Cas功能的部分或全部失活已被用于微调行为，以增强基因编辑，以更严格地控制基因表达或抑制以及用于所有细胞主力和产品应用中的各种 RNAi 策略。此外，基于 CRISPR 的产生 DNA 切口的方法已被用于增强位点特异性整合和突变生成，以用于筛选目的。基因编辑工具是所有生物技术应用的核心，是工业生物技术和生物制药生产领域之间的共同点。

DNA测序

DNA 测序技术与基因编辑创新密切相关，过去 20 年来 DNA 测序技术的进步推动了所有生命的生化生产。常规生产宿主基因组，如大肠杆菌（460 万个碱基对）和酿酒酵母（1200 万个碱基对），分别于 1996 年和 1997 年首次测序并发表，而人类基因组计划于 2000 年发布了第一个人类基因组。完整的序列和组装需要另外 20 年才能完成，部分原因是其它技术进步使得更长、高保真度的测序读数成为可能。

使用平行反应的测序技术的发展实现了高保真度和更长的读取长度，同时降低了成本。传统的 Sanger 测序适用于短读取就足够的项目，通常小于 1kb。通过部署边合成边测序的方法，可以使用直接荧光或合成后检测（通过释放的磷酸基团或 pH 变化）来量化新添加的核苷酸，如 Illumina 和 Ion Torrent 技术中使用的一样。对于超过 500 个碱基对的读取长度，单分子测序技术使用纳米级表面在 PacBio 仪器中进行 DNA 合成，或在 Oxford Nanopore 测序的情况下进行直接检测。

这些技术进步和从Sanger测序到下一代测序方法的各种方法值得进行独立总结。具体而言，在利用驯化的应用中，例如适应实验室进化，DNA 测序提供了关键的见解，并可以为所需表型提供致病突变，这可以应用于工业生物技术和生物制药生产。

同样，对于非常规生物、微生物群落甚至无法在体内培养的生物，测序可以进行基因组挖掘，从而提供关键见解和潜在的新型酶。具体而言，在生物制药领域，全基因组组装对于主力细胞 CHO 细胞来说一直是一个挑战。在过去 5 年内，小分子实时测序与大量支架相结合，生成了最新的中国仓鼠基因组组装，其序列覆盖率为 97%，可直接用于 CHO 细胞应用。DNA 测序技术的持续发展将加快数据收集速度、缩短分析时间，并实现更稳健的注释和组装，从而能够快速研究用于生化生产的细胞系统。

菌株/克隆开发

代谢工程设计、构建、测试周期的一个关键方面是评估菌株或克隆以确定最佳生产者。这个过程可以称为微生物宿主的菌株开发或哺乳动物宿主的克隆开发，并利用驯化和高通量筛选。这些工具可以找到“大海捞针”细胞，这些细胞可能具有适当的基因修饰、所需的酶突变，甚至对工艺杂质具有更高的耐受性。从利用转基因随机整合的传统方法到更有针对性的点突变，都需要进行筛选、以分离所需的表型和相应的细胞。

在工业生物技术和生物制药生产中，单细胞/菌株克隆对于持续生长和生化重现性至关重要。具体而言，在生物制药生产中，需要进行克隆筛选以分离具有良好产品质量属性（例如糖基化或电荷变体）的均质群体。除了发现所需的罕见事件外，还需要开发菌株/克隆以确保最佳生产宿主。虽然传统的菌株/细胞系开发是在体内进行的，但最近的研究正在利用无细胞或混合方法进行生物分子生产。这些系统能够使用细胞裂解物构建复杂的途径网络，与广泛的细胞工程相比，可以通过混合快速多路复用。无论是在体内还是体外进行，细胞系/菌株的开发对于创建生物分子生产平台都至关重要。

驯化

驯化是一种广泛使用的技术，它利用自然或诱导突变来创造多样化的细胞群体并实现工业生物技术和生物制药生产中所需的行为。驯化通常在直接机制未知时使用，它可以根据外部所需的表型选择细胞。驯化或适应性实验室进化 (ALE) 经常用于工业生物技术应用，它利用基于生长的选择来改善生长或对抑制化合物的耐受性。驯化通常在较短的时间范围内进行，较长的研究（30 个以上的生长周期）被称为 ALE。抑制化合物的范围可以从代谢溢流产物到木质纤维素生物质的副产品和用于回收的废弃碳源。ALE 的实施提高了酿酒酵母对乙醇的耐受性，从而提高了产量，并提高了甲醇依赖性甲基营养菌谷氨酸棒状杆菌对甲醇的耐受性/转化率。

通过类似的方法，大肠杆菌、马克斯克鲁维酵母、解脂耶氏酵母和运动发酵单胞菌等多种生物宿主都实现了对苯酚和糠醛等有毒化合物的耐受性。在已知其它机制的情况下，可以应用定向进化，引入有针对性的突变，而不是依赖于全基因组的随机修饰。定向进化通常用于酶或其它小分子筛选，以改进或多样化功能。无论采用何种方法，工业生物技术已经并将继续利用基于进化的方法的优势来实现生产目标。

与此同时，生物制药生产业长期以来一直应用驯化来识别在悬浮培养中生长快速的细胞系和适当的选择标记。具体而言，在 CHO 细胞中，采用随机和化学诱变的驯化方案已使甲氨蝶呤和谷氨酰胺合酶选择系统能够富集具有更高目标蛋白表达的细胞系。在这些情况下，驯化创建的细胞系可使用选择标记和上面讨论的合成生物学工具进一步操作。为了实现高水平生产，各种细胞系类型（包括但不限于 CHO、HEK293 和 Vero 细胞）已从贴壁生长条件适应为悬浮生长条件，以支持高细胞密度。在生物制药生产和工业生物技术中，已部署驯化，以实现多种细胞表型。

高通量筛选

基因编辑和/或改造后，需要进行筛选以确定最佳生产克隆或菌株。随着基因编辑和工具的进步，筛选工作的群体规模急剧增加，同时需要缩短从发现到上市的时间，这需要部署高通量方法。高通量筛选包括细胞培养的小型化和快速分析，以测量所有适当的参数。在生物制药生产和工业生物技术中，高产物滴度、产量和生产率是优化的关键参数。产品质量属性（例如翻译后修饰）也是生物制药筛选的重要参数，而工业生物技术应用可能侧重于使用非传统底物作为另一种筛选指标的稳健增长。考虑到细胞培养的微型化，新技术可以利用微流控装置和独特的几何形状监测从 μL 到 250 mL 规模的细胞，以创建精确的缩小模型。类似地，过程分析技术的并行化和发展使得筛选更大群体成为可能，从而提供了对做出明智决策至关重要的额外数据深度。对于快速分析，微量滴定板历来与荧光或光谱测量一起使用。较新的数据分析已经实现了生物传感器检测、基于电化学的传感器和质谱方法，具体取决于分析物的大小和特性。

机器人技术和先进的自动化技术（包括液体处理系统）彻底改变了高通量筛选的能力和速度。使用简单的模块化组件，这些设备可以很容易地部署在工业生物技术应用中，以测量温度、细胞密度和荧光等在线参数。Chi.Bio系统以12-25 ml的规模运行，与 eVOLVER 技术配对，可以通过一台计算机监控和控制多个微型反应器。虽然这项技术已经用于连续进化应用，但它也可以用于对菌株开发中关键参数进行高通量分析。

此外，微流控技术的部署使得各种筛选方法成为可能，包括活细胞荧光成像。先进的微流控装置可以监测单个细胞的生长，并分离出所需的克隆，以用于工业生物技术和生物制药应用。这些装置使用精心控制的流体运动来筛选和选择大肠杆菌（ SIFT 系统）和哺乳动物细胞系（Berkeley Lights Beacon 系统）。高通量筛选的这些发展提高了使用各种生产宿主的工业和生物制药生产应用中的生物技术生产。将关键产品属性的检测实时或近实时地实现，可以更快速、更明智地做出筛选过程决策，从保留多少克隆到确定最佳条件。驯化和高通量筛选是关键的上游开发技术，被广泛用于工业生物技术和生物制药生产行业，以确定最有效的细胞工厂。

总结

工业生物技术和生物制药生产都具有强大的生物学基础，它们依赖类似的概念、方法和技术。此外，合成生物学、测序技术和高通量筛选的进步在过去 20 年中推动了快速发展，产生了各种新产品。基因工程项目产生的生物化学物质甚至细胞本身具有与食品、燃料和人类健康相关的多种应用。

为了继续推进生物技术的发展，学术界和行业伙伴之间的跨学科合作变得越来越普遍。这些项目或团体扩大了现有的专业知识，使参与者能够利用他们原本无法获得的技能和设备。虽然这些团体代表了学术和工业研究人员在联系方面取得的巨大进步，但很少有人将工业生物技术和生物制药生产的进展联系在一起。跨项目共享细胞系/菌株筛选的技术和最佳实践将使生物制药生产和工业生物技术应用的流程更加高效。一般的工艺开发步骤得以保留，并可以几乎相同的方式实现自动化。同样，可以共享合成生物学工具的发现和构建，以实现更高效的蛋白质表达，无论是作为直接产品还是生化生产的关键催化剂。通过进一步合作，未来的创新可以将工业生物技术和生物制药生产联系起来，以更快地将细胞设计成高效的生物工厂。