工作原理：全自动生化分析仪（四）

四、基本测定方法

（一）终点法（End point method）

根据反应达到平衡时反应产物的吸收光谱特征及其吸光度大小，对物质进行定量分析的方法。对一般化学反应来说，反应完全（或正、逆反应动态平衡）、反应产物稳定时为反应终点。对抗原一抗体反应来说，是抗原和抗体完全反应、形成zui大且稳定的免疫复合物时为终点。在反应时间进程曲线上为与x轴平行线区段。在测定计算方式上，一般分为一点法和两点法两种。

1．一点法（One Point） 以试剂和样品混合之前的空气空白（GB）、水空白（WB）或试剂空白（RB）的吸光度值为测定计算基点，以反应终点的吸光度读数减去空白读数，得到反应吸光度。通过与相同条件下校准液反应吸光度的比较，求得测定结果。常与一点校准法配合使用，即采用一个校准浓度，校准曲线通过零点且成线性。也应用多点校准。

2．两点终点法（Two Point End）即终点一始点法 以试剂和样品混合之后的某一时间点作为始点，以反应终点的吸光度读数减去始点读数。一定条件下可降低样品对反应或反应本身的特异性于扰（主要指色度干扰）。常采用双试剂，多以加R2前某一点作测定始点；某些情况下，也可以加R2后一点作测定始点。若使用单试剂，主反应启动太快或仪器起始读数点受限时难以运用。

固定时间法（Fixed Method）与两点终点法的区别只是在：测定读数的末点不在反应平衡区段，而是根据方法学选择。如血清肌酐（苦味酸法）测定。

3．三点终点法 即双终点法，在一个通道内一次进行两项反应相关的终点法测定。比如同测游离脂肪酸和甘油三酯。某些仪器（如HITACHI系列）设置此方法。

（二）连续监测法（Continuous monitoring method）

又称速率法（Rate Assay）。即连续监测反应过程，根据所测定的产物生成或底物消耗的速度进行定量分析的方法。在反应时间进程曲线上为反应呈恒速区段（斜率保持不变），常用于酶活性线性反应期测定。

1．连续监测法即零级反应速率法，亦称斜率法。在较长的反应时间区段内（至少90-120秒），每隔一定时间（常为2~30秒）读取一次吸光度值，至少读取4点，得到3个△A；一般将连续多次读数作zui小二乘法处理，读数间隔时间太短的作带速率时间（TR）多点法处理，均取线性反应部分的读数，求出单位时间内的反应速率△A/min。此法必须以零级反应为测定计算的基础，因为只有在零级反应下，单位时间内的吸光度变化（反应速率△A/min）才与酶活力呈正比。此法相对减少了分析误差，大大提高了分析速度和准确性。但是，半自动生化分析仪采用单样品连续监测，相当耗时。应用连续监测法，首先应准备线性范围内的高、中、低浓度的样品，分别作反应时间进程曲线，了解不同浓度下反应全过程，兼顾确定延迟时间和线性监测期。

2．两点速率法即所谓拟一级速率法。在反应中选取两时问点t 1、t 2，读取吸光度A 1、A2，计算（A2-A1），（t2-t1）=△A，△t。此方法与终点两点法的区别主要有两点：后一读数点反应未达终点，以速率计算结果。它与连续监测法比较，缺点在于人为确定t 1、t 2，不定因素较多，不能保证反应在t 1-t 2期间呈线性，影响结果准确性；应在常规测定前，先做预试验来确定线性时间段。若在选择的时间段内反应不成线性（如零级反应期短，仪器无法设置或测定），则只能改用终点法。优点在于方法简单；酶活力较低、测定吸光度值较小时，可增加测定时间段而不受仪器连续监测时间点的局限，减少读数误差。

3．速率B法在一个通道内一次进行两项反应相关的速率法测定。它既可以是两项试验测定，也可用于干扰或／及样品空白自动补偿0后一用途的原理是：利用仪器的微机自动处理，在*反应（干扰反应）一直维持线性的前提下，可以从第二反应（主反应）速率中扣除*反应速率的延续影响。如用于消除胆红素转化为胆绿素吸光度下降、对肌酐苦味酸法测定的负干扰等。某些仪器（如HITACHI系列）设置此方法。

（三）空白（blank）校正

在分光光度法中，常利用空白溶液来调节仪器的吸光度零点，或用来抵消某些测定的干扰因素。在生化分析仪测定中，除了采用双或多波长、两点法等排除背景干扰外，常要运用专门空白测定，以便从样品测定吸光度中扣除其影响。正确选择空白校正，对提高准确度起重要作用。

1．试剂空白一般在方法类型和校准模式中，即分为有或无试剂空白两大类。试剂空白单独测定或与校准配合测定，并需预选装载去离子水样品杯或试剂空白架。校准或样品的各测定点吸光度，均要扣除相应测定点的试剂空白吸光度或空白速率值。无试剂空白的方法，多直接以反应杯的水空白作为测定基准值。

在不少仪器中，试剂空白测定类似校准测定，并非在病人样品测定时实时测定。所以，要注意它的测定频率，避免因试剂批号或质量的变化造成试剂空白的改变引起的计算误差。

2.样品空白 主要为了消除样品本身混浊或色度的干扰。常采用空白通道法，测定校正结果=显色反应通道结果-空白通道结果。多数仪器须另外占用测定通道，分析速度减半，但去干扰的准确性应高于两点终点。（完）