巨噬细胞吞噬功能的检测

实验概要

巨噬细胞承担着吞噬、消除细胞内寄生菌、真菌，和清除衰老的自身细胞的职能，它在特异性体液免疫或细胞免疫应答中都有重要作用，所以巨噬细胞的吞噬消化功能，在一定程度上可以反映机体的免疫状态。本实验用体内法和体外法两种方法测定了巨噬细胞的吞噬功能。

实验步骤

1. 体内法

   1) 材料

      a．小鼠健康昆明系小鼠，体重20~25g。

      b．生长液0.5%水解乳白蛋白液(用Hanks液配制，水浴加热溶解)，加10%灭活的小牛血清，用7%NaHCO₃调整pH值为7.6。

      c．细菌悬液将4mg/ml卡介苗(BCG)做8倍稀释(即1份BCG加7份生理盐水)，也可用培养36h的链球菌液体培养物。

   2) 方法

      a．诱导产生大单核细胞具体作法是，①用乙醚将小鼠麻醉(勿致死)，固定四肢，75%酒精消毒腹部，用眼科镊子提起腹部皮肤，沿腹中线剪开皮肤，不得伤及腹膜，然后将皮肤向两侧分开，并固定；②用6号针头往腹腔内注射生长液30ml，轻轻按压腹部，使大单核细胞游离出来。

      b．注射卡介苗在注射生长液后大约5~10min，再往腹腔内注入稀释的卡介苗(BCG) 1ml，或链球菌培养物1ml，并不断地轻轻按压小鼠腹部，约5min后，用9号针头抽取腹腔液，滴加在已消毒的载玻片上(用前以火焰灭菌)，然后放在湿盒内，于37℃孵育30min后，大单核细胞即粘附在玻片上，用生理盐水或Hank′s液漂洗1~2次。

      c．染色及镜检抗酸性染色。如注射的不是卡介苗，可采用普通染色法。染色毕，用油镜检查。

   3) 结果油镜下检验时，可见大单核细胞的胞浆中有许多被吞噬的结核杆菌(BCG)或链球菌。

2. 体外法(皮泡法)

   1)材料

      a. 10%斑蝥乙醇浸出液：取斑蝥10g，加乙醇100ml，于室温下浸出数日后使用。

      b. 鸡红细胞悬液：从鸡翼下静脉或心脏采血，按1∶5比例保存在阿氏液中，放4℃冰箱可供2周使用。临用时取所需量，加生理盐水，1 500r/min离心5min，洗3次，第3次2 000r/min离心5min，弃上清液，取压积红细胞用生理盐水配制成5%悬液。

   2)方法

      a. 皮泡形成：具体方法是：①在动物皮肤被毛稀少的部位，如股内侧、腹部等，剪毛，用剃刀刮净；②用小镊子取1cm²大小滤纸片，蘸上斑蝥乙醇浸出液，贴在剃毛的部位，在滤纸上压一小玻片，上面再敷以清洁纱布，用胶布或绷带固定好；③4~5h后，斑蝥作用部位的皮肤层开始移动，此时可将纱布、玻片、滤纸一并取下，换一个拱形塑料盖，用纱布或胶布固定，以防止水泡破裂；④48h后，在敷斑蝥处的皮肤上形成一个同盖片一样大小的水泡，用无菌注射器小心将皮泡液全部吸出，局部以无菌纱布覆盖，2h后可取下纱布。

      b. 吞噬试验：皮泡液1ml加5%鸡红细胞悬液0.04ml，放小试管内，再将两片小盖玻片(用普通盖玻片分切而成)重叠斜放在试管底部，37℃水浴30min，每10min振摇一次。温育结束后，将小盖玻片从试管中取出(在试管液体内轻轻振荡几次，使游离的鸡红细胞和不贴壁的吞噬细胞从玻片上脱落)，放在载玻片上，吹干后，用瑞氏姬姆萨氏液染色。

亦可将皮泡液1ml 1500r/min离心5min，去上清液，留液体约0.05ml，再加入5%鸡红细胞悬液0.04ml，混匀后，放37℃水浴30min，中间振荡一次。温育后推片，吹干，染色，镜检。

   3) 结果在油镜下观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况，数200个巨噬细胞，可用下述两个指标表示吞噬活性：

      a．吞噬百分比即每100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数。

      b．吞噬指数将100个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞的总数除以100，得吞噬指数，即每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。

另外，计数时，可同时记录鸡红细胞被消化的程度，以供参考。消化程度一般分以下四级：

      Ⅰ级：未消化，胞质浅红或浅黄带绿色，胞核呈现浅紫红色。

      Ⅱ级：轻度消化，胞质浅黄绿色，核凝缩，呈紫蓝色。

      Ⅲ级：重度消化，胞质淡染，胞核呈现浅灰黄色。

   Ⅳ级：完全消化，只见形状类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐，胞核模糊可见。

注意事项

在吞噬试验中，于皮泡液内加少量肝素可防止因纤维蛋白析出而造成的试验失败。本法操作简便，无需复杂的仪器设备，便于推广。