差减cDNA文库法
[第一条链cDNA合成]
1．合成第一条cDNA链时，所有试剂应按下列顺序依次加入：
10×第一条链合成缓冲液 5.0μl
10mM dNTP Mix(1.4μg/μl) 2.5μl(终浓度1.25mM)
Linker primer(1.4μl，终浓度100μg/μl)
DEPc H2O
RNase block Ⅱ(1U/μl) 1.0
mRNA 1~5μg
混合，离心20秒钟，室温放置10分钟
2．加入逆转录酶至1500U/ml，补水到终体积50μl。
3．混合，取出5μl放入含有0.5μg α-32P dATP（800Ci/mM），分别保温在37℃ 1小时。
4．保温后，带有同位素的离心管放入-20℃保存，为以后分析用。第一条链cDNA混合物放在冰上。
[第二条cDNA链的合成]
1．对于总体积为45μl的第一条链混合物按下列次序依次加入：
第一条链混合物 45.0μl
10×第二条链缓冲液 20.0μl
0.1M DTT 8.0μl
10mM dNTP Mix 3.0μl
α-32P dATP（800Ci/mM） 1.0μl
dd H2O 115.0μl
2．混合后，加入：
RNase H (4.0U/μl) 1.0μl
DNA聚合酶（10.0U/μl） 7.0μl
第二条链反应体积200μl，在16℃水中保温2.5小时，注意水温不得超过16℃，保温后立即放在冰上。
3．反应混合物随后用酚，氯仿提取
4．用乙醇沉淀于，-20℃过夜。
5．次日，在4℃，以最大速度离心1小时。
6．用80%乙醇洗一次。
7．冷冻干燥cDNA。
8．最后沉淀物溶于43.5μl的dd H2O，取出4.5μl存入冰箱，作为第二条链分析用。
[填补cDNA末端]
1．在39μl的cDNA溶液中加入: 5.0μl的10×T4 DNA聚合酶缓冲液，2.5mM dNTP混合物。
2．反应物在37℃保温30分钟。
3．酚，氯仿提取。
4．酒精沉淀cDNA，-20℃至少沉淀30分钟。
5．在台式离心机中，以最大速度4℃离心60分钟。
6．80%乙醇洗涤沉淀。
7．冷冻干燥cDNA沉淀。
[连接]
1．在反应总体积10μl中，应有：
1μl 10×连接缓冲液
1μl 10mM ATP
1μl (4 Weiss U/μl)
T4 DNA连接酶，连接子或者Adapter
2．反应在8℃保温过夜。
3．保温后，反应离心管放于70℃30分钟，以灭活DNA连接酶。
[cDNA末端磷酸化]
1．70℃灭活反应后，稍微离心一下，置室温5分钟。
2．在反应混合物（10μl）中加入：
1μl 10×连接缓冲液
2μl 10mM ATP
1μl （10μ）DNA激酶
[限制性内切酶消化]以得到粘性末端
1．限制性内切酶消化DNA和载体。
2．在37℃保温1~5小时，然后冷却到室温，如果选用定向插入，需用两个不同的限制性内切酶消化，可得到两个不同的粘性末端。
[cDNA大小的选择]
1．在50μl的总体积中加入5μl 0×STE缓冲液。
2．Sephacryl S-400柱收集分离出的cDNA。
3．用酚，氯仿抽提。
4．酒精沉淀之后，悬浮cDNA在10μl的无菌水中。
[cDNA和载体连接]载体可用λgt10, λgt11或λZAPⅡ cDNA (0.1~1μg) 2.5μl 10×连接缓冲液 0.5μl 10mM αATP 0.5μl 载体（1μg/μl） 1.0μl T4 DNA连接酶（4 Weiss U/μl） 0.5μl 总体积为5μl 12℃保温过夜，或4℃两天，然后放在室温下2小时。 [包装]试剂由Strategene制备 1．包装提取物从-70℃取出立即放入干冰中。 2．同时化解超声提取物（黄色）。令在手指间溶解冻红色管，到刚刚开始化时，加1μlDNA置于冰上。 3．快速加15μl超声提取物到DNA中，仔细混合，避免气泡，在室温下保温2小时（22℃）。 4．加500μl噬斑稀释缓冲液（SM溶液），再加20μl氯仿，温和的混合。 5．离心弃去噬菌体碎片。这个cDNA文库可以测效价，保存于4℃中。 [制备ZAPⅡ文库的单链cDNA] 1．在一个50ml的圆锥形离心管中，加宿主菌250μl到SM液中： SM液：20mM Tris pH7.5 100nm NaCl 10nM MgSO4 0.2% Gelatin 2．37℃保温15分钟后，加5ml 2×YT（其中每升溶液含10g NaCl, 10g酵母提取物，16g胰酶解胨），37℃摇5小时。 3．然后在70℃保温20分钟。 4．4000g离心5分钟，以除去细菌裂解碎片。回收上清液。这里应含有诱导得到的单链重组噬菌体，同样还会有辅助噬菌体。滴度可以按细菌的形成单位来计算。