生工引物:
①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTCATTCCG-3’
②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCCACGTA-3’
③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’
④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’
⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTCGGCATA-3’
⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’
⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTACGCAAC-3’
⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’
特异引物:
①5ac: 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’
②ck5: 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’
③10ac: 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’
④10acb: 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’
⑤2ben: 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’
⑥3ben:5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’
⑦Phen:5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’
二、 实验方法
2. 总RNA的提取与检测
(1)用品的准备
塑料器皿,如离心管、Tip头等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上,高压灭菌并烘干后使用;所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上,高压灭菌后4℃保存;玻璃器皿经180℃烘烤12小时以上,冷却备用。
(2)试剂的配置
① CSB缓冲液
42 mmol/L 柠檬酸钠(Sodum citrate)
0.83%(W/V)十二烷基肌氨酸钠(N-lauryl sarcosine)
0.2 mmol/L 巯基乙醇(β-mercaptoethanol)(使用前加入)
(3)RNA提取
对悬浮培养细胞A、B进行RNA提取,提取步骤如下:
① 50 ml 离心管中加入10 ml 变性匀浆液,冰浴5分钟。
② 取0.5 g 细胞在液氮中研磨至粉末,转移至预冷的变性匀浆液中,加200 ul β-巯基乙醇,振荡混匀。
③迅速加入1 ml 2 mol/L 乙酸钠(pH4.0),充分混合。
④ 加入10 ml 水饱和酚,剧烈振荡10~15秒,在冰上放置5分钟。
⑤ 加入2 ml 氯仿:异戊醇(24:1),剧烈振荡10~15秒,在冰上放置15分钟。
⑥ 4℃,12 000 g,离心20分钟。
⑦ 小心移取上层水相,弃去中间相和下层有机相。
⑧ 加入6 ml 水饱和酚,剧烈振荡10~15秒,在冰上放置5分钟。
⑨ 加入6 ml 氯仿:异戊醇(24:1),剧烈振荡10~15秒,在冰上放置15分钟