发布时间:2020-06-22 14:39 原文链接: 差示反转录PCR实验(二)

生工引物:

①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTCATTCCG-3’

②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCCACGTA-3’

③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’

④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’

⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTCGGCATA-3’

⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’

⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTACGCAAC-3’

⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’

 

特异引物:

①5ac: 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’

②ck5: 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’

③10ac: 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’

④10acb: 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’

⑤2ben: 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’

⑥3ben:5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’

⑦Phen:5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’

 

二、 实验方法

 

2.  总RNA的提取与检测

 

(1)用品的准备

 

塑料器皿,如离心管、Tip头等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上,高压灭菌并烘干后使用;所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上,高压灭菌后4℃保存;玻璃器皿经180℃烘烤12小时以上,冷却备用。

 

(2)试剂的配置

 

① CSB缓冲液

 

42 mmol/L 柠檬酸钠(Sodum citrate)

 

0.83%(W/V)十二烷基肌氨酸钠(N-lauryl sarcosine)

 

0.2 mmol/L 巯基乙醇(β-mercaptoethanol)(使用前加入)

 

(3)RNA提取

 

对悬浮培养细胞A、B进行RNA提取,提取步骤如下:

 

① 50 ml 离心管中加入10 ml 变性匀浆液,冰浴5分钟。

 

② 取0.5 g 细胞在液氮中研磨至粉末,转移至预冷的变性匀浆液中,加200 ul β-巯基乙醇,振荡混匀。

 

③迅速加入1 ml 2 mol/L 乙酸钠(pH4.0),充分混合。

 

④  加入10 ml 水饱和酚,剧烈振荡10~15秒,在冰上放置5分钟。

 

⑤ 加入2 ml 氯仿:异戊醇(24:1),剧烈振荡10~15秒,在冰上放置15分钟。

 

⑥ 4℃,12 000 g,离心20分钟。

 

⑦ 小心移取上层水相,弃去中间相和下层有机相。

 

⑧ 加入6 ml 水饱和酚,剧烈振荡10~15秒,在冰上放置5分钟。

 

⑨ 加入6 ml 氯仿:异戊醇(24:1),剧烈振荡10~15秒,在冰上放置15分钟