常用的几种细胞凋亡检测方法详细步骤（四）

方法：

1 、悬浮细胞的染色；

（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。

（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

（3）加入PBS-T溶液，37℃孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。

（5）加入5ml FITC标记的TFAR19单抗（终浓度为1：40），4癈反应30min

（6）荧光细胞洗液洗2次，1000rpm′10min。

结果观察：将细胞沉淀滴片，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。[图12]

2、贴壁细胞的原位染色；

（1） 贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。

（2） 将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。

（3） 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ml）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。

结果观察：[图13]

3、临床病理切片的染色、检测；

4、原代细胞的培养、检测；

5、分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的分布及定位。TFAR19蛋白的表达与临床疾病

1． ELISA法检测正常人和疾病状态下，以及疾病的不同时期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平。

材料和试剂：

1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer
   

2. 洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20

3. 封闭液： 3%BSA（用洗涤液配制）

4. 酶标抗体的稀释：用封闭液稀释

5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g

柠檬酸 0.51g

DDW 100ml

6. 显色液（现配现用）：底物Buffer 10ml

OPD 2mg

30% H2O2 2ml

7. 终止液 2Mol/L H2SO48. 重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA Reader（OD490nm），洗板机

操作步骤

1. 用包被Buffer稀释的重组人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37℃孵育2h或4℃过夜（一般24h以上）。
   

2. 洗涤Buffer洗板三次，加入封闭液，200 ml/well ， 37℃孵育2h或4℃过夜。

3. 洗涤Buffer洗板三次，加入不同稀释度的病人血清（3个重复孔）100ml/well ，37℃孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对照。

4. 洗涤Buffer洗板三次，加入1：2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well，37℃孵育1h。

5. 洗涤Buffer洗板三次，加入显色液，100 ml/well，避光反应10~15min。

6. 加入H2SO4终止反应，50 ml/well。

7. ELISA Reader 读取OD490 光密度值，分析和比较病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗体的表达水平。

8． Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表达水平。