常用缓冲液配制

实验概要

常用缓冲液配制

实验步骤

一.电泳缓冲液

　     A: 测序凝胶加样缓冲液:

　　    98%去离子甲酰

　　    10mol/L EDTA(pH8.0)

　　    0.025%二甲苯青FF

　　    0.025%溴酚蓝

        B: 甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG₈混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman 1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。
                                                                    常用的电泳缓冲液

　　 说明：
          （1）TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。以上都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，  故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。

　　（2）碱性电泳缓冲液应现用现配。

　　（3）Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

　　C: 2×SDS凝胶加样缓冲液：

　　  100mmol/L Tris·HCl(6.8)

　　  200mmol/L二硫苏糖醇（DTT）

　　  4%SDS（电泳级）

　　  0.2%溴酚蓝

　　  20%甘油

　　不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。

　　D: 凝胶加样缓冲液

　　   使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。
        选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。

二．各种pH值的Tris缓冲液的配制

某一特定pH值的0.05mol/L Tris缓冲液的配制：将50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水将体积调至100ml