广西大学最新文章：改进染色质免疫共沉淀方法

　　作为研究基因表达调控的重要方法，近年来染色质免疫共沉淀得到了越来越广泛的应用，但有关将乳腺组织作为ChIP材料的研究及其方法尚未见报道。

　　近期来自广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室等处的研究人员提出了一种新型乳腺组织染色质免疫共沉淀方法，这种方法获得的DNA样品中， 靶序列得到显著的富集， 所得的DNA样品能够满足测序（ChIP Seq） 要求。结果说明， 改进后的方法适用于乳腺组织染色质免疫共沉淀， 并为研究乳腺组织基因表达调控奠定了基础。

　　基因的表达受到多种转录因子及其相关蛋白的调控， 基因表达调控常用研究方法包括转录因子结合实验、 电泳迁移阻滞实验、 酵母单杂交系统和染色质免疫共沉 淀 技 术。尽管这4种方法均可以鉴定转录因子在DNA 中的结合位点， 但前3种方法需要将DNA与转录因子分离到体外进行实验， 无法真实地反映在不同生理状态下， 转录因子与相应靶基因识别与结合的真实情况。

　　ChIP技术通过甲醛交联， 将某一时刻DNA与转录因子之间的作用情况“ 快照” 下来， 可真实、 完整地反映特定时刻下， 目的蛋白在全基因组序列中的结合情况， 因此，近年来该技术得到越来越广泛的应用。ChIP研究多以细胞系或从组织分离培养所得的细胞为材料， 但离体培养的细胞无法完全模拟体内细胞相应的生理状态， 无法排除细胞培养过程中对基因表达及其调控产生的影响。已有直接将组织作为

　　ChIP材料、 避免细胞培养可能产生的潜在影响的报道。目前有关组织ChIP方法远不及以细胞 ChIP方法成熟， 相关研究报道也较少， 同时急需进一步研究完善适合不同组织的ChIP方法。

　　ChIP技术通过甲醛交联固定结合在染色质上的蛋白， 经细胞裂解、 染色质断裂， 用结合有相应抗体的沉降珠捕获并分离目的蛋白DNA复合物， 最后经反交联、 纯化后， 得到与目的蛋白结合的 DNA片段。目前大多数利用 ChIP技术对DNA与蛋白之间相互作用进

　　行的研究均是以细胞为材料， 将活体组织作为ChIP材料的报道较少， 尚未有以乳腺组织为 ChIP材料的报道。与脾脏等组织不同， 乳腺组织中含有大量乳腺纤维， 致使样品均一化处理时难以分离得到呈单一状分布的细胞， 且细胞容易破损， 回收率低。泌乳期乳腺细胞裂解后， 裂解液中含有大量的乳脂和乳蛋白， 严重影响杂交效率。超声法断裂染色质过程中易产生积热、 易导致反交联和蛋白质变性， 因此对超声波仪的温控要求较高。

　　针对以上问题， 研究人员以Stat5a为目的蛋白对传统的组织染色质免疫共沉淀方法进行了改进， 寻找适合乳腺组织的染色质免疫共沉淀方法。

　　研究人员省略组织均一化步骤、 用酶切 超声法代替超声法进行染色质片段化、 在细胞裂解和酶切步骤间增加洗涤步骤。结果显示， 与脾脏组织相比， 乳腺组织不适合进行组织均一化处理。酶切 超声法比超声法更适于对乳腺组织进行染色质片段化。采用改进后的 ChIP方法获得的DNA样品中， 靶序列得到显著的富集， 所得的DNA样品能够满足测序（ChIP Seq） 要求。结果说明， 改进后的方法适用于乳腺组织染色质免疫共沉淀。

　　研究人员认为，利用改进后的方法， 将乳腺组织经抗体与磁珠耦合、 组织处理、 交联、 酶切 超声裂解、 孵育、洗涤、 反交联和纯化共8步处理后， 经QPCR方法证实， 得到了富集有 Stat5a靶序列片段的DNA片段， 且样品质量达到华大公司对ChIP样品的测序要求。测序分析结果显示， 利用改进后的ChiP方法获得的样品数据背景干净、 峰形显著、 重复性高， 可满足ChIP Seq要求。

　　这些结果说明， 改进后的方法适用于乳腺组织染色质免疫共沉淀， 该方法为研究乳腺基因表达调控奠定了基础。