应用流式细胞仪检测CD34+细胞方法学评价

应用流式细胞术（FACS）测定动员后的外周血及采集的自体外周血造血干细胞（APBSC）中的CD34+细胞及其亚群，操作简单、快速、重复性好，对及时掌握最佳采集时机，准确判断采集的干/祖细胞数量具有重要指导意义。为准确检测外周血及APBSC中的CD34+细胞，本文比较了几种FACS检测CD34+细胞方法的异同。

1、材料与方法

1.1　外周血造血干细胞　APBSC采集自经环磷酰胺（CTX）＋重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员后的实体瘤患者（淋巴瘤、乳腺癌），采集使用CS3000- Plus血细胞分离机（Baxter公司，美国）。

1.2　CD34+细胞的标记　对10份APBSC分别进行2种不同再处理与CD34标记。
　　1.2.1　溶血法　APBSC与CD34-PE荧光单克隆抗体（Immunotec，法国）室温暗处反应15min，然后用细胞裂解液溶解红细胞，待测。
　　1.2.2　分离单个核细胞法　经Ficoll（相对密度1.007）梯度离心，收集界面层单个核细胞，与CD34-PE标记的单抗室温孵育15 min，待测。

1.3　FACS检测CD34+细胞　上述标记细胞悬液分为2管，其中一管6 h内使用流式细胞仪（EPICS ELITE ESP， COULTER公司）测定CD34+细胞占单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的百分率，另一管经1%多聚甲醛固定，4℃冰箱保存72 h后，FACS测定CD34+细胞数。

1.4　荧光标记的CD34单克隆抗体　33份APBSC同时分别用表达第2类抗原表位QBEnd 10（ClassⅡ，Immunotec）和表达第3类抗原表位8G12（HPCA2，classⅢ，Becton Dickinson）的单抗进行标记，比较2组CD34+细胞百分率之间的差异。

1.5　双标记CD34/CD45　APBSC中同时加入抗CD45-FITC（J33）和抗CD34-PE（HPCA2），用溶血法处理细胞，FACS测定CD34+细胞。

1.6　统计学处理　用t检验。

2、结果

2.1　溶血法与单个核细胞标记法测得CD34+ 细胞百分率无显著性差异（P＞0.50）。

2.2　同一样品经1%多聚甲醛固定72 h后的测定值与6 h内的测定值相比，CD34+ 细胞荧光强度降低，非特异吸附增加，变异系数范围在 9.9%～49.5%之间，平均CV值为32.2%。

2.3　APBSC标本分别用2种CD34单体标记，CD34+细胞百分率无显著性差异（P＞0.05）。

2.4　CD34-PE/CD45-FITC双标记测定APBSC中CD34+细胞的百分率为4.5%，而同一组样品进行CD34+细胞单色标记为5.3%。