引言
用于进行分离和纯化的色谱分离方法与分析型分离方法受到相同物理和化学原理的制约。然而，在制备型试验中，科学家通常在大型柱上和高质量负载下分离化合物，并需要更高的分离度以提高所收集组分的纯度和回收率。虽然设计更缓的梯度是提高分离度的一种较好的首选方法，但改变整个分离过程的梯度斜率可导致峰宽加大和总运行时间增加。可替代普通更缓梯度的聚焦梯度仅对需要增加分离度的色谱图部分减小梯度斜率，从而可在不增加总运行时间的情况下提高对洗脱时间接近的色谱峰的分离度。聚焦梯度可根据搜索运行或者直接从第一次制备运行进行定义。
试验方法
梯度开发步骤
■ 确定制备规模的系统体积
■ 运行搜索梯度
■ 设计聚焦梯度
■ 在制备柱上运行聚焦梯度
试验条件
仪器
液相色谱系统： 沃特世 2525型二元梯度模块、2767型样品管理系统、系统流路组织器、2996型光电二极管阵列检测器、
AutoPurification™流通池
色谱柱： XBridge™制备型OBD™ C18柱19 x 50 mm、5μm（货号186002977）
流速： 25mL/分钟
流动相A： 0.1%的甲酸水溶液
流动相B： 0.1%甲酸-乙腈溶液
波长： 260 nm
样品混合物
磺胺: 10 mg/mL
磺胺噻唑: 10 mg/mL
磺胺二甲嘧啶: 20 mg/mL*
磺胺甲二唑: 10 mg/mL
磺胺甲唑: 10 mg/mL
磺胺二甲异唑: 4 mg/mL
总浓度: 64 mg/mL（溶于二甲基亚砜）
*选定用于聚焦梯度的色谱峰
结果和讨论
确定制备规模的系统体积
■ 取下色谱柱并更换成两通。
■ 流动相A使用乙腈，流动相B使用包含0.05 mg/mL尿嘧啶的乙腈（解决了非加成性混合和粘滞问题）。
■ 在254 nm下进行监测。
■ 采集100% A的基线数据5分钟。
■ 在5.01分钟时，将梯度设置为100% B并再采集5分钟数据。
■ 测定100% A和100% B之间的吸光度差异。
■ 计算存在50%吸光度差异时的时间。
■ 计算步骤开始时（5.01分钟）和50%时间点之间的时间差异。
■ 将时间差异乘以流速。
