开年新篇！施一公团队Science再发剪接体新成果

　　2016年1月8日，清华大学生命学院施一公教授研究组在《科学》（Science）就剪接体的结构与机理研究再发长文（Research Article），题为《U4/U6.U5 三小核核糖核蛋白复合物3.8埃的结构：对剪接体组装及催化的理解》（The 3.8 A Structure of the U4/U6.U5 tri-snRNP: Insights into Spliceosome Assembly and Catalysis），报道了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）剪接体组装过程中的一个关键复合物U4/U6.U5 tri-snRNP高达3.8埃分辨率的冷冻电镜结构，并在此基础上分析了剪接体的组装机制，为进一步理解剪接体的激活及前体信使RNA（pre-mRNA）剪接反应的催化机制提供了重要分子基础。该结构与2015年8月施一公研究组报道的分辨率为3.6埃的裂殖酵母（Schizosaccharomycs pombe）剪接体结构的对比揭示了剪接体在pre-mRNA剪接反应过程中作为核酶（ribozyme）的催化本质，是RNA剪接研究领域的又一重大进展。

　　剪接体作为真核细胞中催化pre-mRNA剪接过程的执行者，是真核生物最基本的分子机器之一，对于正常生命活动具有至关重要的作用。基因的错误剪接或剪接体的错误调控与许多疾病相关。在剪接反应过程中，组成剪接体的大量蛋白质和核酸分子按照高度精确的顺序进行结合和解聚，在此过程中伴随大规模的结构重组，依次组装成命名为E、A、B、Bact、B*、C、P、ILS等等的一系列大分子复合物，从而实现对内含子与外显子交界位点的识别，以及内含子的切除和外显子的拼接。在近二百种剪接体组分中，U6小核RNA（snRNA）包含对于剪接反应具有直接催化活性的尿嘧啶核糖核苷酸（Uridine）。该核苷酸是如何在起始时被保护从而处于失活构象、又如何在适当时机被释放激活从而行使催化功能，是揭示剪接体工作机理的核心问题之一。剪接体成分复杂多变、构象高度动态，所以对于剪接体组装及催化过程中各复合物的结构生物学研究是最基础也是最富挑战性的生物学难题之一。

图1 U4/U6.U5 tri-snRNP电镜密度及三维结构示意图。

　　U4/U6.U5 tri-snRNP是剪接体组装过程中最大也是最保守的预组装复合物，它由U5小核核糖核蛋白（snRNP），U4、U6 snRNA和其他蛋白因子组成。在该复合物中，U6 snRNA呈现失活构象。U4/U6.U5 tri-snRNP与A复合物结合形成B复合物，再经过一系列成分、构象重组后，U1、U4 snRNP解离，剪接体形成，U6 snRNA从而被激活。所以，tri-snRNP的加入是组装成具有催化活性的剪接体这个过程中不可或缺的一步，其高分辨率结构的解析对于揭示pre-mRNA剪接反应的分子机理至关重要。早期对于该复合物的结构研究分辨率较低，仅有2纳米，除了显示一个三角形的外观之外基本不能提供更多信息。2015年6月，英国分子生物学实验室Nagai研究组利用冷冻电镜将其分辨率提高至5.9 埃，定位出多个组分，显示了一些二级结构，但由于分辨率所限，仍不足以搭建原子模型。

　　在施一公研究组最新发表的《科学》论文中，他们探索并优化了蛋白提纯方案，获得了性质良好的酿酒酵母U4/U6.U5 tri-snRNP复合物的蛋白样品，并利用单颗粒冷冻电镜技术重构出了总体分辨率为3.8埃的三维结构，核心区域分辨率更是高达3.0-3.5埃，从而首次将该复合物分辨率推进至近原子分辨率，并搭建了该复合物的原子模型（图1）。该结构清晰显示由于U6与U4 snRNA的碱基互补配对作用和蛋白因子Prp3的保护作用，U6 snRNA中的催化核苷酸Uridine 80被稳定在失活构象。

图2 pre-mRNA与tri-snRNP结合。

　　在此高分辨率的结构中，一个出人意料的发现是U4/U6.U5 tri-snRNP复合物中存在着与之结合的pre-mRNA。该pre-mRNA通过与U5 snRNA和U6 snRNA碱基互补配对被识别，其5’剪接位点中高度保守的鸟嘌呤核糖核苷酸（Guanine）被关键蛋白Prp8特异性识别。这一发现为剪接体的组装和剪接反应的催化提供了新的见解（图2）。

　　医学院三年级博士生万蕊雪、清华大学生命学院博士后闫创业为本文共同第一作者；医学院一年级博士生白蕊和生命学院二年级博士生王琳参与样品制备和数据收集；施一公教授为通讯作者。中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所黄超兰研究员与黄敏参与样品质谱鉴定的合作。电镜数据采集于清华大学冷冻电镜平台，计算工作得到清华大学高性能计算平台、国家蛋白质设施实验技术中心(北京)以及联想高性能计算的支持。本工作获得了北京结构生物学高精尖创新中心及国家自然科学基金委的经费支持。