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D-木糖异构酶 葡萄糖异构酶 酶学实验手册 第三章
葡萄糖异构酶是应用最多的酶之一，本质上它是木糖异构酶而非葡萄糖异构酶。它从各种各样的微生物中分离得来，它在微生物体内作为木糖代谢物。半纤维素，像木聚糖或阿拉伯糖，是最丰富的自然营养物质之一，包含了世界上大约 40％ 的生物量。它由木聚糖酶裂解，木聚糖酶是由生物体分泌到基质中的外泌酶，能使多聚结构分裂成单糖单位像木糖，单糖单位可被细胞重新吸收并被木糖异构酶转化成木酮糖，木酮糖激酶通过激活 D-木酮糖-5-磷酸使木酮糖进入磷酸戊糖途径。由于结构相似，葡萄糖可以被相同的酶异构成果糖，但效率比较低（转化因子大约是 5，取决于微生物各自的酶）。这个酶是一个同源四聚体，单个亚基的相对分子质量约为 45 000，而天然酶则接近于 200 000，每个亚基都有两个必要的二价金属离子，一个与催化反应直接相关。另一个用来维持天然结构。Mn2＋ 是对木糖酶最有效用的离子，而对于葡萄糖反应有 Co2＋ 会更有活性。在失去催化活性时，金属离子能可逆地与 EDTA 结合，这种酶相当稳定即使来源嗜温菌的酶也能在 50℃ 进行测定。
来源：《酶学实验手册》
D-木糖异构酶测定
D-木糖异构酶微板分析
葡萄糖异构酶的测定实验
葡萄糖异构酶微板测定
| 实验方法原理 |
D-木糖 ⇌ D-木酮糖 |
|---|---|
| 实验材料 | 酶溶液 |
| 试剂、试剂盒 | TES NaOH D-木糖MnSO4 半胱氨酸·HCl 咔唑溶液 硫酸 |
| 仪器、耗材 | 分光光度计 |
| 实验步骤 |
实验所需「试剂」具体见「其他」
20 ul 的实验混合物和 20 ul 酶溶液（各自用 20 ul TES 缓冲液作对照）混合，并在测定温度（例 50℃）下紧靠反应容器放置 15 min，在用冰冷却并加入 40 ul 半胱氨酸和 40 ul 咔唑溶液的情况下酶反应会停止，加入 1.2 ml 70％ 硫酸颜色开始变化，在室温下放置 10 min 后对比参照，在 546 nm 处测吸光值。
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| 注意事项 |
过任何时间颜色也不会达到一个恒定量，因此，每隔 10 min 必须非常仔细地观察颜色的变化，在同样的时间间隔后所有的样品都被准确读数。空白对照的吸光值应该大约是 0.2，如果吸光值接近 0.3 则测定反应物需重新配制。为了定量，需要准备木酮糖的校对曲线，木酮糖浓度应在 0～10 umol/L 之间。
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| 其他 |
试剂： 0.2 mol/L TES/NaOH，pH 8.0［N-tris（羟甲基）-甲基-2-氨甲基酸，Mr＝229.3；9.2 g 溶于 100 ml 水中，用 1 mol/L NaOH 调节至 pH 8.0，用水加至 200 ml］ 0.4 mol/L D-木糖（Mr＝150.1；1.2 g 溶于 20 ml 水中） 0.03 mol/L MnSO4（单水化合物，Mr＝169.0；57 mg 溶于 10 ml 水中） 1.5％ 半胱氨酸·HCl（半胱氨酸·HCl-水合物，Mr＝175.6；溶解 1.5 g 在 100 ml 水中） 0.12％ 咔唑溶液（Mr＝167.2；120 mg 溶于 100 ml 乙醇中） 70％ 硫酸
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