primer的一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的primer和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度 是必需的。在理想状态下,退火温度足够低,以保证primer同目的序列有效退火, 同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比primer的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交,适用于小于18碱基的primer。
有的是根据GC含量估算Tm。确定primerTm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测primer的杂交稳定性。大部分计算器程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及primer序列的不同,Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值,所有退火温度 只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃,以2℃为增量,逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少primer二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果,两个primer应具有近似的Tm值。primer对的Tm差异如果超过5℃,就会primer在循环中使用较低的退火温度 而表现出明显的错误起始。如果两个primerTm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。
或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度 先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
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