引物的设计原则

引物设计原则

1、长度：15—30bp，其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。

2、G十C含量：应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。

3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。

4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。

5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。

6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。

7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。

8、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。