张锋参与发表CRISPR新研究成果

　　2016年7月29日，国际学术期刊《Journal of Biological Chemistry》在线发表了哈佛大学医学院、麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所和山西眼科医院等处的一项最新研究成果，题为“The Clustered, Regularly Interspaced, Short Palindromic Repeats-associated Endonuclease 9 (CRISPR/Cas9)-created MDM2 T309G Mutation Enhances Vitreous-induced Expression of MDM2 and Proliferation and Survival of Cells”，哈佛大学医学院眼科系Schepens眼科研究所的Hetian Lei博士是本文通讯作者，CRISPR/Cas9技术的先驱开创者之一、Broad研究所的张锋（Feng Zhang）博士以及山西省眼科医院的段雅剑（Yajian Duan）博士也是本文共同作者。

　　增生性玻璃体视网膜病变（Proliferative vitreoretinopathy，PVR）是一种威胁视力的疾病，是由孔源性视网膜脱离（RRD）以及开放性眼外伤的手术矫正引起的，其特征是形成视网膜前膜（ERMs）。ERMs是由细胞外基质蛋白和细胞（包括视网膜色素细胞、视黄醛细胞、纤维母细胞和巨噬细胞）组成。PVR发生在8%到10%接受RRD手术修复的患者当中，并占术后所有原发性故障的大约75%。

　　致癌基因蛋白MDM2是一个泛素蛋白连接酶，其人类同源物（也叫HDM2）是p53肿瘤抑 制因子的一个重要的负调节因子；MDM2无效的胚胎小鼠致死表型，可以通过敲除p53基因而被阻止。实验兔的玻璃体优先激活血小板衍生生长因子受体 α（PDGFRα）。这种激活转而会启动磷酸肌醇3激酶（PI3K）/ Akt下游的信号通路，从而提高p53的降解。用小分子Nutlin-3阻断MDM2 与p53结合，可在PVR家兔动物模型中保护家兔免于视网膜脱离。

　　有趣的是，在MDM2启动子位点中的单核苷酸多态性（SNPs）（rs2279744）的 G等位基因，随后被发现与RRD患者较高的PVR风险相关。这个SNP还与致癌风险增加相关。MDM2第一内含子启动子位点上的SNP T309G（在第309个核苷酸的一个T到G的变化），可增强转录激活因子特异性蛋白（Sp）1的亲和力，从而导致MDM2的表达升高，以及随后p53在 肿瘤细胞中的表达减弱。然而，这个SNP是否有助于PVR的发病机理，仍有待于探索。

　　细菌和古细菌中的CRISPR和CRISPR相关核酸酶（Cas），提供了适应性免疫力对抗病毒和质粒，它们的CRISPR RNAs（crRNAs）被用来指导外来核酸的Cas裂解。在化脓性链球菌（Sp）中，Cas9（SpCas9）包含两个核酸酶结构域——RuvC和 HNH，当被crRNA和tracrRNA引导时，每个能裂解双链靶DNA的一条链。这个SpCas9可以被重编程为使用处理后的sgRNAs（由 crRNA和tracrRNA组成）靶定哺乳动物细胞中特定的基因组位点。

　　CRISPR/Cas9产生的特定基因组位点上的DNA双链断裂（DSBs），可以通过内 源性修复机制——非同源末端连接（NHEJ）和同源性修复（HDR），而得以修复，这取决于细胞状态和一个修复模板的存在。NHEJ和HDR是细胞中两种 截然不同的修复途径。NHEJ能够引入不可预知的插入和缺失（indel），它可以通过简单地再连接两个DSB末端，而修复病变；HDR可以使用一个外源 性的单或双链DNA模板——具有预期的变化，在基因位点产生突变。然而，与NHEJ相比，HDR不常使用，因为它只发生在S和G2期，而NHEJ可以发生 在整个细胞周期。最近，CRISPR/Cas9技术被用于真核细胞和小鼠的各种基因组编辑应用中，它提供了一个独特的机会来证明“MDM2 和T309G是否有助于PVR的发病机制”。

　　在这项研究中，研究人员利用CRISPR/Cas9技术，在人类原发性视网膜色素（hPRPE） 细胞中的MDM2基因组位点产生了T309G突变。研究人员利用双腺相关的病毒衍生载体，将SpCas9和引导RNAs，连同一个同源修复模板，传递到靶 向MDM2基因组位点，以在人类原发性视网膜色素上皮细胞（其基因型是MDM2 T309T）中产生MDM2 T309G突变。

　　新一代测序结果表明，利用腺相关病毒CRISPR/Cas9编辑过的hPRPE细胞中，有42.51%的MDM2 G309。这些数据表明，玻璃体可诱导MDM2的表达增加，以及随后p53在MDM2 T309G hPRPE细胞中的表达减弱。此外，这些实验结果表明，hPRPE细胞中的MDM2 T309G可增强玻璃体诱导的细胞增殖和存活，从而表明这一SNP有助于PVR的发病机制。