当外泌体遇上环状RNA（二）

（4）circUHRF1通过miR-449c-5p相关途径来抑 制NK细胞功能
作者利用生物信息学预测了14个miRNA，在NK-92细胞中进行circUHRF1-RIP以及qPCR，结果表明miR-449c-5p是NK-92细胞中一个与circUHRF1相互作用的miRNA。在NK-92细胞中进行抗AGO2抗体的RIP和生物素化miR-449c-5p的RNA pull-down实验，证明了circUHRF1可以直接与miR-449c-5p结合。此外经双荧光素酶报告实验和分别在NK-92细胞中过表达circUHRF1和miR-449c-5p，证明了在NK细胞中circUHRF1和miR-449c-5p可能相互靶向。此外单独过表达miR-449c-5p会显 著抑 制肿 瘤的活性，但增加circUHRF1表达显 著抑 制miR-449c-5p的肿 瘤抑 制功能，说明HCC衍生的外泌体circUHRF1通过miR -449c-5p相关途径抑 制NK细胞功能。

（5）circUHRF1通过抑 制miR-449c-5p来上调TIM-3的表达

作者分析了NK细胞中预测的miR-449c-5p靶基因TIM-3，同样进行了双荧光素酶报告实验，结果显示miR-449c-5p能直接与靶基因TIM-3的3’UTR区直接结合。超表达miR-449c-5p后TIM-3表达显 著降低。为了验证NK细胞中外泌体circUHRF1的持续上调吸附miR-449c-5p，从而导致TIM-3的表达上调造成HCC的免疫逃避这一观点。作者检测了miR-449c-5p单独或与circUHRF1共同转染的NK-92细胞中TIM-3的表达。结果显示，miR-449c-5p超表达导致TIM-3 mRNA和蛋白表达水平下降，而circUHRF1逆转了miR-449c-5p的抑 制作用。在体内同样证实了circUHRF1通过调控miR-449c-5p/TIM-3轴来阻碍NK细胞的功能。

（6）circUHRF1以NK细胞依赖性方式促进HCC进展
为了进一步探讨circUHRF1在HCC中的作用，使用pLO5-ciR-circUHRF1上调了PLC / PRF / 5细胞中circUHRF1的表达。qPCR结果显示，在过表达circUHRF1的HCC细胞中，外泌体circUHRF1水平也显 著上调。此外，使用PLC/PRF/5细胞构建肺转移的NOD/SCID小鼠模型(注射来自健康供者的NK细胞)。结果表明，在接种过表达circUHRF1细胞的肺转移小鼠内，血浆外泌体中circUHRF1水平更高，肺部的转移瘤结节更多及结节内NKG2D阳性细胞更少。说明，circUHRF1以外泌体和NK细胞依赖性的方式促进HCC进展。

（7）circUHRF1可以提高肝ai对抗PD1治 疗的耐药性
分析了30例进行肝切除术并接受抗PD1免疫治 疗的HCC患者的资料并测定circUHRF1的表达水平，结果表明，PD组的circUHRF1水平明显高于SD组和PR组。此外，检测了30例HCC患者组织中NKG2D的表达水平。结果表明，与抗PD1治 疗敏感的HCC患者相比，抗PD1治 疗耐药的HCC患者中NKG2D的阳性细胞数明显减少。为直接评估circUHRF1对抗PD1治 疗的影响，通过皮下植入circUHRF1基因敲低的HCCLM3细胞或相应的阴性对照细胞来构建小鼠移植瘤模型。结果表明，植入circUHRF1基因敲低细胞的小鼠对抗PD1治 疗敏感，并伴随总生存率的提高。根据上述研究，过表达circUHRF1可以提高HCC对抗PD1治 疗的耐药性，而靶向circUHRF1可能是恢复HCC对抗PD1治 疗敏感性的有效方法。