彩色显带实验

实验材料 常规细胞遗传学方法制备的染色体标本

试剂、试剂盒 RxFISH 探针甲酰胺乙醇甲醇冰乙酸SSCHClTween-20兔抗 FITC 抗体DAPI

仪器、耗材 染色缸湿盒橡皮泥相差显微镜水浴锅烤箱微量移液枪微型离心机离心管冰箱RxFISH Cyto Vision 系统荧光显微镜冷CCD摄像机

实验步骤

一、标本制备和老化

1.用甲醇/冰乙酸固定的方法制备细胞悬液。

2.滴一滴细胞悬液于载玻片上，在染色体铺展所需的适宜温度（25°C) 和湿度（45%?50%) 条件下干燥标本。

3.用相差显微镜检测标本片的质量，在玻片上画出染色体分散良好或感兴趣的中期染色体区域。

4.在 60°C 烤箱中放置 2 h，老化当天制备的标本；或在 60°C 烤箱中烤 1h 老化室温过夜的片龄 1d 的标本片。将老化后的标本置于室温下，以备进行 RxFISH 的后续步骤。

5.标本在室温下的 70%、85% 和 100% 系列乙醇中各脱水 2 min，空气干燥。

二、变性和杂交用溶液的配制

1.配制 70% 乙醇，放于一 20°C 冰箱中。

2.配制 50 mL70% 甲酰胺/2XSSC(pH7.5) 放在 72°C 水浴锅中。

3.配制 70%、85% 和 100% 乙醇，室温保存。

4.准备湿盒，37°C 预热。

三、探针变性

1.将装有 RxFISH 探针的离心管在 37°C 水浴中预热 5 min。

2.轻轻混匀，稍离心。

3.用无菌枪头按每张标本 IOyL 的探针量移液到 0.5 mL 离心管，盖好管盖。

4.将不用的 RxFISH 探针放回一 20°C。

5.65°C 水浴中变性 RxFISH 探针 lOmin。

6.将变性过的探针于 37°C 水浴中放置 IOmin?2 h 备用。

四、标本变性

1.确保染色缸内的 70% 甲酰胺/2XSSC 溶液温度为理想的 72°C(见注释 1 和 2)。

2.在 70% 甲酰胺/2XSSC 溶液中变性标本（不超过 4 张）1.5 min(见注释 3)。

3.迅速将变性标本于一 20°C 冰冷的 70% 乙醇中淬灭（见注释 4)。

4.将标本依次在室温条件下的 70%、85% 和 100% 系列乙醇中各脱水 2 min，空气干燥。

五、杂交

1.降低环境亮度，避免 RxFISH 探针光漂白（见注释 5)。

2.取 10uL 变性探针混合物加在标本片上画出的杂交区域（含有分散良好的染色体或感兴趣的中期分裂相）。

3.缓慢盖上 25 mmX25 mm 盖玻片，避免产生气泡。

4.让探针溶液铺展到盖玻片的边缘，轻扣盖片，在不移动盖片的情况下排除气泡。

5.用橡皮泥封片。

6.37°C 湿盒中孵育 48 h(见注释 6)。

六、配制杂交后步骤所需溶液

1.配制 150 mL2XSSC 溶液（pH7.0)，分装在 3 个染色缸中，放在 45°C 水浴锅中（见注释 7)。

2.配制 IOOmL50% 甲酰胺/0.5XSSC 溶液（pH7.0)，分装在 2 个染色缸中，放在 45°C 水浴锅中。

3.分装 50 mLpH7.5 的 4：XTween 溶液（500 mL4XSSC 和 0.25 mLTween-20 储存液）在 1 个染色缸中，放在 45°C 水浴锅中。

七、杂交后洗脱

1.用镊子小心除去橡皮泥，将标本放入第一缸的 2XSSC 中 45°C 孵育 5 min，滑落盖玻片（见注释 8~10)。

2.在 50% 甲酰胺/0.5XSSC 溶液中洗片 5 min，将标本转到下一缸同样溶液中，重复洗片 5 min。

3.在 2\83(^溶液中洗标本 51^11，将标本转到下一缸 2\38(：溶液中洗 5 min04. 将标本转到 4XTween 溶液中，45°C 孵育 IOmin。

八、抗体检测步骤（可选择的）

1.在上述的 3.7 中的第二次甲酰胺洗片的同时，室温条件下 14OOOg 离心两种检测 FITC 的抗体 lOmin，只用上清进行下面的实验。

2.在小离心管中加入 1ul 兔抗 FITC 抗体和 199uL 4 X Tween 溶液，轻轻混匀稀释液。室温避光孵育 10 min。

3.甩去标本上的多余液体。

4.向每张标本片加 200ul 兔抗 FITC 抗体 1:200 稀释液，37℃湿盒中孵育 30 min。

5.将水浴锅温度由 45°C 降至 42°C，预热装有 4XTween 溶液的 50 mL 染色缸，同时预热 6 次洗脱所需的 250 mL45XTween 溶液。

6.检查以确保水浴锅和 4XTween 溶液温度为 42°C。然后移去标本上的盖片，洗片 5 min。倒掉溶液，加入新鲜预热的 4XTween 溶液，再洗片 5 min。重复一次该步实验。

7.在洗脱的过程中，向另一离心管中加入 2uL FITC 标记的山羊抗兔 IgG 抗体和 198juL4XTween 溶液，轻轻混勻稀释液。室温避光孵育 lOmin。

8.甩去标本上的多余液体。

9.向每张标本上加 20(^LFITC 标记的山羊抗兔 IgG 抗体 1:100 稀释液，37°C 湿盒中孵育 30 min。

10.检查水浴锅和 4XTween 溶液温度为 42°C，然后洗片 3 次，每次 5 min。

九、DAPI 复染

将 10UL 复染剂和抗淬灭剂溶液加到标本上，并用盖玻片（22 mmX22 mm) 封片（见注释 11)。

十、图像捕获和分析

1.打开计算机，在研究菜单下选择 RxFISH 软件。打开软件后，选择捕获界面。开始图像捕获前，将滤色块轮设定到适合的顺序。捕获的探针信号保存在原始图像图层中，组合得到最终图像。Rx_Cy5 信号最先捕获，随后依次是 Rx-Cy3、Rx-FITC 和 Rx-DAPI。

2.用 FITC 进行中期扫描。FITC 荧光信号不容易淬灭，所有的分析过程可以保持明亮。当找到一个中期后，在 100X 油镜头下聚焦，然后选择 Rx-Cy5。

3.肉眼无法观察到 Rx-Cy5, 需要依赖计算机图像来了解详细信息。当曝光设定为 5s 时，应能够在黑暗背景下检测到微弱的白色图像。缓慢聚焦增加清晰度，因为在照相机和软件之间存在时间延迟。调节明暗直至得到好的对比度（约 90% 准确度）。针对不同的图像设置应略微调整。

4.点击「Live」按钮，滤色块轮将自动转到列表中的下一个荧光滤色块。大多数情况下其他的荧光信号曝光 2s 即可。一旦得到清晰带型的图像时，点击「Capture」按钮。

5.完成所有 4 个突光信号的捕获后，选择标记有「RxFISH Image Capture」的界面。在选择的界面内，完成整套图像的合成。保存所有的图像，即使有提示也不要删除，这些图像在分析中非常有用。

6.激活「Analysis」菜单，选择你想要分析的细胞。选择「Loadcell」将显示多色显带的染色体（见注释 12)。在「AnalysisCustomize」菜单下，RxFISH 图像也可显示为 DAPI 反转图像，可帮助识别染色体。「AnalysisProfile」工具用于显示每条染色体强度曲线。

7.用「Analysis」命令可分开染色体，只要一完成染色体分离，就可用「Classifier」和「Auto」命令产生细胞的核型。

注释

1.变性步骤是操作程序中非常关键的。变性时间和温度由标本的类型和片龄决定。每个实验者应根据自己需要确定适宜的温度和时间。一般在 70~75°C 温度范围和 1.5?2 min 时间范围内能够得到好的结果。

2.整个实验过程中，应在使用前检查每个染色缸中的液体温度。通常染色缸中的液体温度比水浴锅的温度至少低 TC。

3.每张室温标本放入 72℃甲酰胺中将降低 70% 甲酰胺/2 X SSC的溶液温度 0.5~1°C; 如果一次放人超过 4 张标本，70% 甲酰胺/2XSSC 的温度将不足以进行变性。

4.如果处理超过 4 张标本片，70% 甲酰胺/2XSSC 和第一缸 70% 乙醇必须调回它们的初始温度，即分别为 72°C 和一 20°C。

5.Cy5 荧光染料在红外波长范围内非常敏感，易被白光激发，因此在图像捕获过程中，应首先进行捕获，因为它将第一个淬灭掉的荧光。

6.标本在 37°C 湿盒中杂交 12~96 h。探针杂交时间不要少于 12 h，因为这会使信号強度将大大降低。杂交 48 h 能够得到稳定的强信号，这是成功捕获图像所必需的。可根据各实验室的经验减少杂交时间。

7.为确保结果的质量，每天倒掉使用过的溶液。变性步骤中用的溶液不能储存起来用于杂交后洗脱步骤。

8.杂交后洗脱的步骤应在弱光的条件下完成，避免直接标记突光染料（Cy5 和 Cy3) 光漂白。

9.在杂交后的所有实验步骤中，标本片不能干掉。

10.如果盖片不能从载片上滑下来，将标本片放于 2XSSC 中再次洗脱 5 min，再检查盖片是否滑落。

11.标本片在一 20°C 避光保存，以备拍照。

12.如果染色体彩色带型颜色比较淡，不够明亮，在比较暗的设置下（减少曝光时间）重新捕捉图像。在图像捕捉前调好焦距，缩短曝光时间以减少延迟。

照相机有个芯片收集荧光，然后将信息传递到计算机中，这就是为什么出现延迟的原因。DAPI 图像不应该太暗，它为其他荧光颜色提供背景。如果 DAPI 图像不够亮，染色体看起来边缘参差不齐。由于同样的原因，调节好 DAPI 图像的焦距是很有必要的