四氮唑比色法广泛用于皮质激素类的测定，但当药物被分解破坏(C17-α-醇酮基被氧化)后即无此反应。所以分解产物对本法无干扰，但在测定过程中受到各种因素的影响，如反应温度和时间、水分、PH值、氧和光线等。
1、温度与时间的影响
呈色速度一般随温度增高而加快，但在室温或30℃恒温条件下显色易得重现性较好的结果，反应时间视供试品和试剂的种类不同而异。中国药典多数在25℃暗处反应40~45分钟。
2、取代基的影响
反应原理是C21-羟基被四氮唑氧化，当C21-羟基酯化后，其反应速度较C21-羟基游离时的反应速度慢；酯化的酰基结构越复杂则反应速度越慢。
3、空气及光线的影响
反应及其产物对光及氧敏感，因此必须用避光容器并置于暗处显色，同时在达到最大呈色时间后，立即测定吸收度。TTC法形成的产物对空气中氧敏感．显著影响颜色的强度和稳定性，因此英国药典规定在加入试剂后要往容器中充氮气。
4、溶剂和水分的影响
多数采用95%的乙醇，但有时为了减少整个反应液中水分的含最则采用无水乙醇。含水量过大会使呈色速度减慢，含水量不超过5%时．对结果几乎无影响。醇中的醛类杂质必须除去，因为少量乙醛会使吸收度增高，故一般使用无醛醇作为溶剂。
5、碱的种类和浓度
最常用的是氢氧化四甲基铵，能得到满意结果。一般用甲醇或乙醇将10%的氢氧化四甲基铵溶液稀释后再用，反应完毕后溶液中碱的浓度通常约为0.01mol/L。
6、干扰物的影响
有些还原性物质如抗坏血酸、还原糖、硫醇、多元酚等都能与四氮唑盐反应而引起干扰，但在甾体激素原料和制剂的分析中不易遇到。某些赋形剂如聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂对BT法有较显著的干扰，山梨醇和角鲨烯也有干扰，因此，测定油膏、冷霜等制剂时必须先分离才能测定。